通過研究發現，過氧化氫（H2O2）是癌細胞中可自由擴散的分子之一，被認為是瞭解細胞生理和病理的重要細胞信號分子。其中，正常的生理的H2O2水平在產生和分解代謝之間保持平衡。然而，在癌細胞中的H2O2水平會顯著增高，H2O2會從活細胞擴散到細胞膜上。因此，實時監測活細胞釋放H2O2對了解腫瘤細胞間的行為和異質性具有重要意義。但是，目前定量和區分從活細胞中釋放的H2O2還具有挑戰性，因為它在細胞外微環境中具有快速擴散、自然分解和稀釋至超低濃度的特性。雖然利用電化學、比色法和化學發光法等分析技術可以檢測H2O2，但是對於生物相容性更好、製備更簡單的信號探針、擴散距離更短和背景干擾更低的檢測技術還需要進一步的研究。
基於此，清華大學的林金明教授和國家納米科學中心的Lin Ling（共同通訊作者）聯合報道了一種利用辣根過氧化物酶（HRP）進行功能化的液晶彈性體微球（LCEM-HRP），可以將其直接固定在細胞膜上，進而實時監測單細胞水平上H2O2的釋放。LCEM-HRP可以通過同中心向徑向（C-R）變形來報告H2O2，這是由於LCEM-HRP中的H2O2被HRP催化還原而引起的去質子化和LCEM-HRP中鏈間或鏈內氫鍵的斷裂所致。其中，LCEM-HRP的變形水平顯示了從細胞釋放H2O2的不同量。在檢測時間為10 min內，固定在細胞上的LCEM-HRP的估計檢測靈敏度為〜2.2×10-7μM。此外，研究人員還從不同構型的LCEM-HRP中探索了細胞系和細胞的異質性。總之，LCEM-HRP通過原位實時成像監測從活細胞中釋放的H2O2提供了一種新方法，並且可以作為尋找用於細胞微環境中各種信號分子成像的更高級化學探針的基礎。該研究成果以題為“Monitoring H2O2 on the Surface of Single Cells with Liquid Crystal Elastomer Microspheres”發佈在國際著名期刊Angew. Chem. Int. Ed.上。
【圖文解讀】首先，研究人員通過溶解二丙烯酸酯液晶（2-甲基-1,4-亞苯基雙（4-（（（丙烯酰氧基）己基）氧基）苯甲酸酯）（RM82）、E7（LC）中的7-辛烯酸（7OAc）單體和偶氮二異丁腈（AIBN）合成了直徑約2 μm和天然徑向構型的LCEM。接著，利用辣根過氧化物酶（HRP）對液晶彈性體微球（LCEM）進行化學修飾形成LCEM-HRP，並將其直接固定在細胞膜上，以實時監測從單活細胞中釋放的H2O2。與LCEM相似，LCEM-HRP在pH=7.4的水溶液（去離子水，DIW）和細胞培養基（MEM）中表現出徑向構型。通過將熒光染料若丹明標記的HRP（HRPrhd）結合到LCEM（LCEM-HRPrhd）上，可以確定將HRP固定在LCEM上。
圖1、LCEM-HRP的工作原理和表徵
接著，研究人員研究了在pH=6.7下、不同H2O2濃度（0.5-5 M）的溶液，發現LCEM和LCEM-HRP都具有響應性。在此pH下，LCEM和LCEM-HRP均表現出同心構型。但是，在0.5 M的CH2O2處觀察到LCEM-HRP有輕微同心向徑向變形，在CH2O2>0.5 M時徑向構型更加明顯。在CH2O2=1.2 M處，LCEM的同心構型得以保留，而LCEM-HRP顯示C-R變形。利用電子自旋共振（ESR）光譜檢測了在H2O2存在下LCEM-HRP產生自由基氧物質（ROS）的情況。從H2O2+HRP和H2O2+LCEM+HRP中觀察到DMPO-OH和DMPO-OOH的ESR信號，而在LCEM-HRP和H2O2的存在下，•OH信號顯著淬滅。將LCEM-HRP置於pH=6.7的H2O2（1.2 M）溶液中，以評估其可逆變形。添加H2O2後，LCEM-HRP的初始同心構型變為徑向構型。
圖2、LCEM-HRP對H2O2的響應
然後，研究人員將LCEM或LCEM-HRP分散在細胞培養基（MEM）中，並使其固定在微通道中的細胞上。最初，LCEM-HRP在HUVEC細胞上還表現出徑向構型，在A549、U87和HepG-2細胞上表現出同心構型。但是，LCEM-HRP並未保持其同心構型，在分析時間為10 min下，在A549、U87和HepG-2細胞上觀察到了C-R變形。LCEM和LCEM-HRP都在HUVEC細胞上保留了其徑向構型，而在初始時就在U87、A549和HepG-2細胞中觀察到了快速的R-C變形。所以這種R-C變形是由於腫瘤細胞的酸性環境所導致。LCEM在腫瘤細胞上保持其同心構型，而LCEM-HRP隨著時間的推移顯示出反向的C-R變形。這種C-R變形是由於HRP催化從細胞釋放的H2O2減少所導致。此外，由於合成代謝的改變，其他信號分子也從腫瘤細胞中釋放出來，以滿足細胞增殖的高生物合成需求。
圖3、LCEM-HRP在不同時間固定在各種細胞膜上的POM圖像
研究發現，實時監測從活細胞釋放的信號分子可以提高對靶向疾病以及新治療和診斷方法的瞭解。因此，研究人員通過在10 min內達到100個單細胞上的LCEM-HRP構型分析了不同細胞系之間的差異性。統計分析表明，不同的細胞系釋放的H2O2具有顯著的差異。LCEM-HRP的形狀分為從初始同心到預同心、預徑向和徑向四個階段。72％的A549、14％的U87和僅2％的HepG-2細胞釋放的H2O2足以帶來完整的C-R變形。這些結果表明，LCEM-HRP提供了一種可靠的方法來分析從活細胞釋放的H2O2，並繪製了細胞系和細胞-細胞異質性圖。
圖4、LCEM-HRP用於映射細胞系和細胞間異質性
【小結】
綜上所述，LCEM-HRP提供了一種以單細胞分辨率下原位實時成像檢測從活細胞中釋放的H2O2的可靠方法。LCEM-HRP探索了不同腫瘤細胞系表面相同的細胞間的異質性。LCEM-HRP不會發生內吞作用，因此可以簡單地固定在細胞膜上，具有較高的細胞相容性、較低的運行成本、超高的靈敏度以及短的分析時間（10 min）。此外，LCEM-HRP可以成為追求更先進的化學探針以監測來自活細胞的各種信號分子成像的基礎。
文獻鏈接：
Monitoring H 2 O 2 on the Surface of Single Cells with Liquid Crystal Elastomer Microspheres （Angew. Chem. Int. Ed., 2020, DOI: 10.1002/anie.202004326）
來源：高分子科學前沿
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