進化上保守的p53蛋白及其細胞通路通過對環境擾動的感知、調節和整合反應介導腫瘤抑制，從而導致細胞死亡或維持細胞穩態。
p53和MDM2蛋白是該通路中的中心樞紐，該樞紐通過MDM2接收壓力輸入，並通過p53作出反應，通知和改變細胞中許多其他通路和功能。MDM2-p53與細胞中其他信號通路高度相關，這可能是為什麼TP53是人類癌症中最常見的突變基因。在癌症發展的早期，外胚層和中胚層來源的組織特異性幹細胞和祖細胞中產生TP53基因的初始或截斷突變（幹細胞中的第一個突變），然後發生其他突變，會在這些組織中產生腫瘤。內胚層來源的組織特異性幹細胞或祖細胞中，TP53突變作為晚期突變，使突變細胞轉變為惡性腫瘤。在幹細胞中，癌基因或腫瘤抑制基因的功能選擇順序影響著腫瘤的發生時間和發展。TP53基因家族在多細胞動物發育過程中已經進化了6億至8億年。自從發現該基因家族以來，已經花了40年來了解為什麼TP53基因是人類癌症中最常見的突變基因。顯然我們還有很多東西要理解，但也已經知道了不少。2020年5月13日，美國科學院院士、普林斯頓高等研究院系統生物學中心榮譽教授——Arnold J. Levine在《Nature Reviews Cancer》發表題為“p53: 進化了8億年的基因——40年的發現 - 知乎p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery"的文章，系統介紹了p53基因。主要包括三個方面：首先，TP53基因家族的進化及其成員在無脊椎動物和脊椎動物中的功能。其次，TP53突變在多種癌症中的作用——TP53突變在哪些組織類型的幹細胞或祖細胞中起作用或不起作用，在這些不同的組織類型中TP53突變的順序。最後，細胞中p53途徑的功能結構和幾何結構如何影響其功能、p53途徑收集和整合的信息以及該途徑如何響應。這些信息彙總到一起，有助於我們理解為什麼編碼p53的基因的突變是人類癌症中最常見的單一特徵。
p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery
MDM2，是一種E3泛素連接酶，通過蛋白質修飾增加或降低其對p53蛋白的親和力，或改變其對p53蛋白底物的連接酶活性來應對各種內在和外在的細胞應激。通過應激信號抑制MDM2的活性會延長p53蛋白的半衰期，並迅速激活其轉錄功能。然後p53轉錄一組基因，從而介導修復這些壓力引起的損傷或誘導細胞凋亡。MDM2和p53形成複合物，激活並調控p53通路，該中樞將MDM2與壓力信號連接在一起（圖1和2），從而導致MDM2與p53的結合較弱且無法泛素化（圖1），使得p53穩定或較高的連接酶活性與p53結合，導致蛋白酶體中的p53降解。 因此，MDM2-p53中樞起始於與許多應激信號、MDM2和p53蛋白以及蛋白酶體降解機制之間的廣泛交流。一旦p53穩定並激活，它就通過轉錄與一系列廣泛的細胞信號轉導通路相互作用（圖3），包括細胞死亡或應激誘導的細胞損傷修復等許多不同的細胞功能。
圖1. 應激信號導致p53激活
圖2. 應激信號導致p53抑制
圖3. p53對不同類型應激反應的轉錄輸出
十多種不同的應激信號介導了p53細胞濃度的增加及其轉錄激活（圖1）。其他的細胞應激導致p53活性降低（圖2）。許多不同的病毒和細菌編碼的基因產物可以滅活或降解p53。造成這種情況的原因是病毒和細菌感染可以激活p53的各種檢測器分子，然後啟動細胞死亡程序。這種激活會吸引巨噬細胞、誘導衰老相關的分泌表型（SASP），募集自然殺傷細胞和CD8 + T細胞到感染部位，導致細胞死亡，並被巨噬細胞吞噬。p53介導的編碼巨噬細胞抑制性細胞因子1（MIC-1;也稱為GDF-15）的轉錄、翻譯和分泌會吸引巨噬細胞，這是直接或主要的p53轉錄本（即具有p53反應性DNA元件）。SASP相關基因似乎是次級轉錄本，受初級p53轉錄本產生的蛋白質調控。通過這種方式，許多其他信號轉導途徑，例如此處討論的先天性和適應性免疫反應，都與MDM2-p53複合物有關。
p53家族
人類的p53樣轉錄因子由TP53、TP63和TP73這三個基因編碼。p53、p63和p73的蛋白質結構相似，三個DNA結合結構域在結構上幾乎相同，與相似的DNA特異性序列結合，並調節一些相同基因和不同基因的轉錄。C-末端結構域在大小、序列和功能上互不相同，並調節DNA的結合和轉錄、介導蛋白質內和蛋白質間的功能性相互作用。這三種蛋白質的N端序列都編碼至少兩個不同的轉錄激活域。
與p53相似，p63通常通過誘導細胞死亡來對DNA損傷做出反應，但在雌性和雄性生殖細胞系中。p63也是在整個人體鱗狀細胞上皮產生和再生中的關鍵轉錄因子，並參與顱面結構、四肢和中樞神經系統。p73是產生纖毛上皮細胞所必需的，因此在包含這些細胞的許多組織中起作用（雄性生殖系、免疫系統、聽力、氣管、肺、中樞神經系統等）。
在小鼠和人中，許多不同的組織特異性幹細胞會持續存在並在整個生命中自我複製。例如，小鼠結腸幹細胞可以響應組織特異性生長因子（例如WNT）在培養基中複製和擴增，從而形成類器官併產生在這些組織或器官中發現的許多細胞類型。在小鼠和人中，組織特異性幹細胞通過正常的細胞更新不斷地替代衰老的組織。哺乳動物每天會產生數十億個新細胞。例如，結腸每4天會翻新，皮膚每28天更新一次，並且不斷產生血細胞。這很可能是人和某些其他哺乳動物的壽命比p53: 進化了8億年的基因——40年的發現質量壽命三角所預測的壽命長的原因之一（質量壽命三角為哺乳動物的質量和壽命之間提供了很好的關聯）。與其他相同質量的哺乳動物相比，人類的性成熟和生殖時間也較晚，並且生殖年齡晚與壽命長相關。最後，人類在發育過程中會產生複雜的結構（如大腦），這種結構會在出生後持續並且在繁殖開始後不久就會持續。顯然，長壽命需要大量組織特異性幹細胞來在這段時間內再生組織。
質量壽命三角
但是，可以在生命週期內不斷替代衰老和瀕死細胞的組織特異性幹細胞對生物體也有一些不利之處。組織特異性幹細胞遍佈全身，並在我們的一生中自我繁殖。它們還可以分化為不再複製的終末細胞類型。Irving Weissman表示，這些幹細胞“是組織形成、種系發育和癌症發展的自然選擇單位” 。人體中幹細胞（小腸、結腸和肝臟幹細胞）每年複製並積累約40個突變（該值是通過類器官的全基因組測序分析確定的，類器官是從3至87歲的人類供體不同組織克隆的幹細胞中獲得的）。
當幹細胞在調節細胞生長和/或分裂，DNA修復或細胞死亡的途徑中積累突變時，可以選擇這些細胞，因為其適應性增強，導致更多的細胞分裂或更少的細胞死亡。這種選擇增加了包含初始（或截短）突變的幹細胞的數量，我們將其定義為組織特異性幹細胞選擇的第一個突變。
初始突變和選擇
最近，我們提出某些癌基因或抑癌基因突變最初在不同的組織特異性幹細胞中起作用，進而通過克隆增加組織中的細胞數量，產生一個小的良性腫瘤。一旦發生這種情況，克隆中的初始突變將選擇一組特定的次級突變。儘管突變可以以任何順序發生，但是組織特異性幹細胞中其他突變的功能選擇以特定順序發生，然後進一步選擇賦予克隆和腫瘤更高適應性的突變。
這種選擇首先是在結腸癌中觀察到的。在結腸癌中，不同個體中不同基因突變的順序（APC，RAS，然後是SMAD4突變）引發一系列越來越大的良性腫瘤，隨後是TP53中的第四個突變導致惡性腫瘤。這項工作之後，利用正常的組織特異性結腸類器官，使用CRISPR–Cas9將突變引入這些幹細胞中，以檢測突變順序對惡性腫瘤產生的影響。這些實驗表明，突變順序對於腫瘤有效產生至關重要，而隨機順序則無效。最終，在小鼠中證明了這種特定順序最快速地產生結腸癌。組織特異性幹細胞和突變順序在別處也有證明。
突變順序至關重要
TP53種系突變雜合的Li–Fraumeni綜合徵患者可以發展為嬰幼兒腫瘤，包括脈絡叢癌、腎上腺皮質癌、橫紋肌肉瘤和某些類型的髓母細胞瘤。青少年和成年患者中最常見的腫瘤是成骨肉瘤、軟組織肉瘤、血液腫瘤、神經膠質瘤和膠質母細胞瘤，以及雌激素受體陽性、孕激素受體陽性乳腺癌。老年人最常見的腫瘤是結腸癌和肺癌（圖4）。為了解釋為什麼遺傳性TP53突變可再現不同年齡不同組織類型的腫瘤，我們假設在某些組織特異性幹細胞（如外胚層和中胚層來源的幹細胞）中，初始或截短的TP53突變具有啟動良性腫瘤的功能，而在其他組織特異性幹細胞（如內胚層來源的幹細胞）中，TP53突變不會對錶型或細胞分裂造成任何影響，直到其他突變發生。一個典型的例子是在自發性結腸癌中，導致p53功能喪失的TP53突變是在APC、RAS和SMAD4突變後最後發生的一個突變，進而引起惡性轉化。相比之下，正常結腸幹細胞中TP53的功能喪失突變沒有這種影響。這些結果表明癌基因或抑癌基因僅在特定的細胞類型中起作用，才會對細胞生長產生影響。因此，突變順序對腫瘤的發展很重要。
圖4. Li-Fraumeni綜合徵患者發生特定癌症的風險過高
另一個結果也支持這一假設（圖4）。與普通人群相比，在Li–Fraumeni綜合徵患者中，早期罹患帶有TP53遺傳突變的癌症的風險大約是外胚層來源的組織（髓母細胞瘤和脈膜叢腫瘤）和中胚層來源的組織（腎上腺皮質癌和橫紋肌肉瘤）的癌症發展的250~500倍。在中年（18-45歲）中，患有Li-Fraumeni綜合徵的女性患者中有50％患上雌激素受體陽性、孕激素受體陽性乳腺癌。這是因為種系TP53突變賦予乳腺癌發展的高風險（乳腺癌發生在外胚層來源的組織中），但此外，這些腫瘤始終需要高水平的雌激素和孕激素來驅動，將腫瘤的發展時間推遲到青春期或成年早期。在自發性乳腺癌中，當TP53突變不是截短突變或初始突變時，TP53突變多見於三陰性亞型。相比之下，內胚層組織中癌症的發生風險（如，Li-Fraumeni綜合徵患者的結腸癌和肺癌）僅為2-4倍，這些癌症僅在生命的晚期才發生（圖4）。有趣的是，在大約70歲的年齡之後，具有TP53基因遺傳突變的人患癌症的額外風險低於沒有種系TP53突變的人患癌症的風險（圖4）。yinqi這些觀察結果最簡單的解釋是，TP53突變可以有效充當初始的截短突變（遺傳突變），迅速將外胚層或中胚層來源的組織賦予惡性腫瘤；然而，在TP53突變之前，如果癌基因或抑癌基因沒有其他突變，內胚層來源的幹細胞中的相同突變就無法啟動腫瘤生長。這些流行病學觀察表明，與內胚層幹細胞相比，外胚層和中胚層幹細胞中的p53途徑及其功能不同。
一生中，複製的組織特異性幹細胞將積累突變。組織特異性幹細胞的初始突變賦予的複製優勢可導致器官中幹細胞或祖細胞的自限性克隆擴增。皮膚或食管上皮細胞中的NOTCH突變導致克隆擴增，產生良性生長，其中某些可能是由各個細胞克隆中的其他突變所產生的癌症的前兆。同樣，在擴增的髓系克隆中已鑑定出表觀遺傳調控基因DNMT3A和TET2以及p53通路基因TP53，PPM1D、ATM和CHEK2突變的髓系前體，突變數隨年齡和誘變劑暴露而增加。在此，“早期”失活的TP53突變可能使隨後的表觀遺傳突變發揮作用並增強其表型，包括NRAS、KRAS和FLT3在內的基因發生其他（“晚期”）突變後會發展為急性髓細胞性白血病。
BRCA1和TP53突變
在一系列有序事件中初始突變選擇下一個突變的機制是什麼？DNA損傷修復基因中既有遺傳突變又有自發突變，是這一問題的最佳例證。遺傳和自發的BRCA1和BRCA2基因突變（易患卵巢癌和乳癌）通常都帶有特定的TP53突變。BRCA1或BRCA2的失活突變導致細胞修復受損DNA的能力降低。受損的DNA被ATM識別，最終導致p53穩定並增加p53依賴的轉錄和蛋白質-蛋白質相互作用，從而導致凋亡細胞死亡，或BRCA1或BRCA2突變的細胞的DNA修復。因此，在野生型p53的細胞中，BRCA1或BRCA2失活突變的表型效應（可能導致惡性轉化）會受到抑制。確實，癌症中許多DNA損傷修復基因的突變與TP53突變同時發生。例如，BRCA1突變的癌症中有70~90％的TP53基因也有突變。BRCA2失活突變的癌細胞表現出DNA損傷，但是與BRCA1突變的腫瘤相比，這些細胞中TP53突變的頻率較低，具體原因尚不清楚，但可能涉及可能使p53失活的轉錄後或翻譯後機制。
RAS和TP53突變
在許多RAS突變的腫瘤，例如肺、結腸和胰腺癌中，TP53突變的比例也很高。早期的研究表明，過表達KRAS的大鼠成纖維細胞通常會經歷複製性衰老，這一反應可通過同時表達顯性負性p53或突變p53導致轉化而逆轉。特別是，KRAS途徑激活導致ARF表達增加，從而抑制MDM2，激活p53穩定和細胞衰老。體內KRAS突變似乎也會激活野生型p53，使幹細胞或祖細胞進入衰老狀態，這會誘導SASP，導致免疫細胞介導的衰老細胞清除，從而阻止野生型p53存在時表達KRAS的細胞轉化。大多數表達KRAS的細胞只有在攜帶Trp53失活突變時才具有選擇優勢。野生型TP53的KRAS突變細胞可能通過另一種仍未知的機制使p53蛋白或衰老途徑失活。
導致CRC信號通路失控的遺傳變化的多樣性和頻率
PML–p53通路是另一種途徑，可以在RAS激活的正常細胞中誘導衰老。在RAS突變的情況下，野生型p53被激活為轉錄因子，並激活編碼PML蛋白的基因的轉錄（圖3），形成核小體，其中p53被組蛋白乙酰化酶乙酰化並啟動細胞衰老的轉錄程序。ARF–p53或PML–p53通路以及各種功能網絡（p53途徑和表觀遺傳途徑）之間的相互作用將在下一部分中詳細討論。
表觀遺傳調控和TP53突變
幹細胞或祖細胞中的初級突變如何導致選擇特定的次級突變的第三個例子是表觀遺傳調控突變，導致表觀遺傳活性和修飾發生較大變化，對TP53突變的活細胞可導致p53介導的凋亡選擇。這首先Cre介導的DNMT1基因缺失的小鼠中得到證實，DNMT1將甲基轉移到CpG二核苷酸中新合成的胞嘧啶殘基上，該殘基與DNA模板鏈中的甲基化GpC二核苷酸配對。在Cre介導的重組條件下，DNMT1不會發生CpG甲基化，細胞會失去表觀遺傳標記，導致兩次細胞分裂後細胞凋亡。在這些小鼠中刪除Trp53時，細胞不會響應Dnmt1基因敲除而發生凋亡。當一些細胞逃脫這種由p53介導的凋亡並開始分裂時，它們就會變成癌性的。這些實驗表明，p53可以檢測異常的表觀遺傳變化，而這些變化會導致細胞死亡。
其他改變表觀遺傳變化的方法也支持這種解釋。例如，在細胞培養中，在人或小鼠成纖維細胞中過表達四種特定的轉錄因子會導致表觀遺傳標記的去除和多能幹細胞的脫分化。在培養中發生這種情況的效率非常低（0.1~1％），需要數週或數月時間產生這些幹細胞。但是，在失去野生型p53蛋白的情況下，效率可以提高到80％，去分化的時間減少到幾天。這些實驗證明p53蛋白對錶觀遺傳應激作出反應。
第三種實驗也支持這種觀點。將氮雜胞苷或地西他濱藥物摻入RNA和DNA中，從而防止CpG二核苷酸中胞嘧啶殘基的甲基化。與表達野生型p53的細胞相比，這些藥物殺死具有p53功能喪失或缺乏p53表達的細胞的頻率更高。在裸鼠移植瘤模型中也有類似觀察。在突變p53的存在下，對這些藥物的反應使腫瘤生長減慢，而表達野生型p53的腫瘤對這些藥物則無反應。這些觀察結果的一種解釋是，野生型p53通過防止摻入或修復而在DNA中維持正常的表觀遺傳標記，而具有p53突變的細胞則不能做到這一點，大量的表觀遺傳變化會殺死或損害藥物處理的細胞。
因此，無論是使用藥物、轉錄因子還是突變來改變細胞DNA中的表觀遺傳標記，與野生型p53相比，p53的喪失或p53活性降低似乎都使細胞對錶觀遺傳修飾敏感。
這三個例子——對DNA修復缺陷的反應、對細胞分裂的忠誠以及對錶觀遺傳功能的監測——將這些信號轉導途徑與MDM2-p53途徑聯繫起來。MDM2-p53
至少14個不同的壓力信號向MDM2-p53通路中的MDM2傳導信息。MDM2和p53的翻譯後修飾和蛋白質-蛋白質相互作用導致下游信號轉導的微調。高水平p53加上翻譯後修飾可誘導多種蛋白質間相互作用並誘導轉錄程序（圖3）。p53的初級轉錄本位於許多不同途徑的節點上，包括調節細胞週期的蛋白質，導致停滯在G1期（p21抑制cyclin E2）或G2期（阻斷MDM2介導的CDC25C降解、p53介導的CDC25C轉錄抑制和p53降低G2-M過渡所需的cyclinB1水平）。這些導致細胞週期停滯的不同機制是MDM2-p53通路冗餘的極好例子。細胞週期的M期是由中心體啟動有絲分裂紡錘體開始的，而p53直接調節中心體的複製，因此在分裂的細胞中只有兩個中心體，以確保染色體的正確分離。
代謝通路是MDM2-p53參與的另一功能網絡。p53誘導TP53誘導的糖酵解和凋亡調節劑（TIGAR）的轉錄，這是一種在腫瘤發生過程中降低糖酵解活性和活性氧（ROS）水平的蛋白質。p53還誘導SCO2（細胞色素氧化酶2），這是一種在細胞核中編碼調節線粒體呼吸的蛋白質。p53誘導TIGAR和SCO2總體上降低了癌症代謝的Warburg效應。線粒體中由p53調控的基因編碼的蛋白質Parkin在DNA損傷後介導線粒體吞噬並停止ROS活性，對Warburg代謝過程也有相當大的影響。谷氨醯胺酶2（GLS2）是線粒體相關的p53調控基因產物，可將谷氨醯胺轉化為穀氨酸，一旦轉化為α-酮戊二酸，便進入TCA循環。穀氨酸鹽還可以作為谷胱甘肽的前體，從而防止ROS。p53誘導sestrins，這些蛋白進一步將其與ROS調節和mTOR信號轉導聯繫起來。p53調控編碼PTEN的基因，5'-AMP激活的蛋白激酶（AMPK）和tuberin（TSC2）的β亞基，可調控哺乳動物mTORC1和mTORC2的靶標，而這對於有效翻譯以及細胞生長和分裂的調控至關重要（圖3）。因此，通路中與細胞週期和代謝過程的廣泛溝通，基因或節點的冗餘和反饋循環，確保了通路的穩健性。這裡有五個已知的p53調控基因，可降低ROS水平並控制Warburg效應。這些基因或節點中一個甚至兩個丟失不會對通路的決策或信息傳遞產生實質性的影響。這些觀察結果還表明，p53途徑如何確保細胞組分的忠實複製和細胞週期中的有序進展，同時通過調節代謝過程有效地提供營養和底物。這些當然是達爾文選擇、複製和有效利用資源的主要要素。
MDM2-p53通路的強大之處
MDM2-p53通路的強大之處在於提供備用功能。因此，如果通路或節點中的某個元素髮生故障，則可以使用第二種甚至第三種方式來彌補功能的初始損失。例如，在各種各樣的組織特異性幹細胞中，可能會發生四個或五個突變，每個突變都在不同的功能途徑中並以特定順序進行選擇，以產生惡性腫瘤。即使在兒科癌症中，很少有一個突變事件會引起癌症。
出人意料的是，儘管野生型MDM2-p53調控下游基因網絡的能力確實很強大，但突變引起的p53丟失卻切斷了整個途徑。p53突變通路似乎沒有這種強大的備用能力。如果單個突變使整個途徑及其所有有用信息失活，那麼這個途徑就不可靠。為什麼還會以這種方式進化？在p53網絡中，許多不同類型的壓力都連接到由MDM2和p53蛋白組成的單個節點，它們以振盪的方式相互連接。p53通過激活MDM2轉錄來啟動自身的降解（圖3）。
為什麼TP53是人類癌症中最常見的突變基因？
對於現有結構（所有輸入和輸出都有一個p53節點），一種常見的解釋是，同時發生的多種不同的壓力和信號需要傳遞到p53節點，以調整細胞對各種壓力組合的響應。
信號轉導網絡使用單個節點或蛋白質更有效地整合輸入組合，而不是使用多個節點和多個連接交叉集成信息。信號轉導網絡使用單個節點或蛋白質而不是使用多個節點和多個連接來交叉集成信息，可以更有效地整合輸入組合。與對十種不同的p53樣蛋白中的某些蛋白進行修飾相比，對單個蛋白進行修飾可以更好地整合信息。要整合十個不同的p53樣蛋白節點，以便它們能夠應對三種不同的壓力，需要一個比單個p53節點複雜得多的網絡體系結構，因此具有較高的錯誤率和較低的信息含量。比如，如果有兩種壓力發生，就需要兩個獨立的信號來修飾一個p53蛋白的兩個位置，或者需要兩個信號來修飾十個類似p53的蛋白中的兩個。兩種途徑的步數相同。接下來，修飾後的單個p53蛋白會因蛋白修飾而改變構象，與適當的基因結合以產生聯合應答，從而解決這一問題。但是，十個p53樣蛋白結構必須在十個節點之間發出信號，以確定哪些蛋白被修飾，然後用三個獨立的轉錄因子做出適當的反應組合。這需要在路徑中採取許多額外的步驟，錯誤的機會增加，信息內容的質量會降低。單一的中央信息集成可以為通路提供更好的架構。
壓力和壓力大小的溝通不當，如DNA損傷，可能會導致細胞損傷嚴重時無休止地試圖修復DNA，而正確的反應是細胞死亡。不斷修復其DNA的細胞無法如實複製。這表明，進化很可能選擇了一個單一的MDM2 p53樞紐，因為它選擇了由p53控制的細胞、組織和器官的常見壓力組合。
這些整合壓力輸入和輸出的高級功能解釋了p53腫瘤抑制不是簡單地由一個、兩個或三個p53靶基因介導的，而是由p53介導的轉錄反應的組合。由於該通路具有冗餘性，下游一個或兩個p53靶基因的缺失可以通過高階整合有關應激反應的信息來彌補。因此，p53介導的腫瘤抑制是對環境變化的整合和調節反應的協調集合，從而導致修復和細胞體內平衡。
參考文獻：Levine, A.J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.Nat Rev Cancer(2020).
