司馬睿的祖父琅琊王司馬伷是司馬懿庶子，司馬睿父司馬覲為司馬伷長子，初拜冗從僕射，後襲爵琅邪王，平生碌碌，地位顯赫。
司馬覲去世，年僅十五歲的司馬睿依例襲琅邪王爵。同年司馬衷即位，賈南風掌權，引起宗室諸王不滿，政治動盪不安。離帝室中心較遠的司馬睿無兵無權，為避殺身之禍，他採取恭儉退讓的方針，儘量避免捲入鬥爭的旋渦。
這樣做反而得到了名士嵇康之子嵇紹的高度評價，並且在司馬睿在洛陽交好琅琊王氏的王導，這為他後來渡江建立東晉打下了基礎。
八王之亂進入高潮，司馬越征討司馬穎時司馬睿也被拉到軍中，任左將軍，時年29歲。司馬越在蕩陰大敗後，逃回封國東海。
司馬衷、司馬睿等都被劫掠入鄴。不久司馬睿的叔父東安王司馬繇因得罪司馬穎而遭殺害。司馬睿害怕禍事殃及自己，潛逃出鄴。
晉懷帝司馬熾即位後，司馬睿被封為安東將軍、都督揚州諸軍事。後來在王導的建議之下前往建康，並且極力結交江東大族。
建興四年，劉曜長圍長安，12月11日，晉愍帝投降，西晉亡。後來司馬睿在建業稱帝，史稱東晉。
司馬睿即位後勢單力薄，皇位不穩，於是重用王導，王導使南北方士族先後支持司馬睿，穩定了東晉政權，維持了偏安局面。於是司馬睿任命王導他為宰相，執掌朝政。
南渡江東之後，王導成為朝堂重臣，堂哥王敦控制長江中上游，王氏家族近屬居內外之任，佈列顯要者人數甚多。琅琊王家也達到了權勢的高峰，四分之三的朝野官員是王家人的或者與王家相關的人。以王導、王敦為代表所構成的王氏家族勢力在當時是非常牢固的，這使"王與馬共天下"的局面在江左維持了二十餘年。
司馬睿也曾試圖壓制琅琊王氏，但被王敦起兵攻入建康，看太子太子司馬紹有勇有謀，想要廢了他，後來因為其他大臣不同意而作罷。由此司馬睿和他的朝廷成了擺設。
司馬睿見大權旁落，心情憂憤，逐漸臥床不起，之後想為太子找一個好老師輔助他，但是不久找的老師司馬荀就病死了，司馬睿病情更加加重。
在位6年後，司馬睿病死，終年47歲。活過了八王之亂，一朝登基為帝，卻只能任人擺佈，朝臣都不聽號令，怪不得司馬睿會憂鬱病死。
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