2019新型冠狀病毒（2019-novel Coronavirus, 2019-nCoV）因2019年武漢病毒性肺炎病例而被發現[1]，2020年1月12日被世界衛生組織（World Health Organization， WHO）正式命名。此次中國武漢發現的2019-nCoV是一種先前尚未在人類中發現的新型冠狀病毒，迄今為止共發現7種可感染人類的冠狀病毒，包括：屬於α屬冠狀病毒的HCoV-229E和HCoV-NL63和β屬冠狀病毒HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV和2019-nCoV [2-8]。2019-nCoV具有較強的傳染性，主要通過呼吸道飛沫傳播，亦可通過接觸傳播，對公共衛生安全和人類的健康有很大的威脅。其感染的臨床症狀主要是發熱，可合併乾咳、乏力、呼吸不暢等症狀，流涕、咳痰等其他症狀少見[9]，嚴重者快速進展為急性呼吸窘迫綜合徵（Acute Respiratory Distress Syndrome， ARDS）、膿毒症休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出現凝血功能障礙[10]。隨著疫情防控形勢的變化，基於目前對新型冠狀病毒感染的肺炎的病原、流行病學、臨床特徵等特點的認識，國家衛生健康委於2020年1月21日將新型冠狀病毒感染的肺炎納入法定傳染病乙類管理，採取甲類傳染病的預防、控制措施。截止2020年2月9日，中國已經累計報告確診40171例2019新型冠狀病毒病例，死亡病例為908例。日本、新加坡、泰國、韓國、澳大利亞、馬來西亞、德國、越南、美國、法國、加拿大等國家也相繼出現了疫情[11]。冠狀病毒的實驗室檢測主要包括病毒核酸檢測、抗原和抗體檢測及作為病毒感染診斷“金標準”的病毒分離鑑定。其中核酸檢測具有周期短、靈敏度高、易標準化等優勢而廣泛應用於病毒的病原學診斷工作[12]。在2019年的武漢疫情中，中國的研究人員採用高通量測序技術開展mNGS宏轉錄組測序分析，24小時內鑑定了2019-nCoV的相對丰度，並獲取了全基因組序列及突變位點，為該病毒診斷工具及疫苗的研製奠定了重要基礎[13]。基於TaqMan探針法的實時熒光PCR技術具有簡單、快速、準確的優勢，已廣泛應用於臨床病原體的檢測，在2003年我國爆發的SRAS病毒的疫情控制方面做出重要貢獻，是WHO推薦的MERS-CoV病毒檢測方法之一，目前實時熒光RT-PCR技術已被列入我國2019-nCoV診療指南[14] ，國內已有數十家企業針對該病毒建立了體系進行檢測，但仍然存在試劑供應不足，且檢測結果準確性不佳，假陰性率嚴重等問題，市場亟需高質量的2019-nCoV核酸檢測試劑以輔助臨床醫生對疑似患者進行快速確診[15-18]。因此本研究針對ORF1ab和N基因，設計特異性引物及TaqMan探針對2019-nCoV進行雙重檢測，同時為提高試劑檢測結果的準確性，採用人管家基因作為內參基因對樣本質量進行監控，建立了新型冠狀病毒2019-nCoV核酸特異的多重實時熒光RT-PCR檢測方法。
一、 材料與方法
1.材料：（1） 主要試劑引物、探針、熱啟動Taq酶、c-MMLV酶、陽性病毒樣顆粒樣本、核酸提取或純化試劑盒（磁珠法）（粵穗械備20170583號和粵穗械備20150302號）均由中山大學達安基因股份有限公司提供，RNasin購自普洛麥格（Promega，北京）生物技術有限公司。（2）主要儀器 Smart 32核酸提取儀由中山大學達安基因股份有限公司提供，ABI 7500實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。
2.方法：（1）引物和探針的設計與合成根據全球流感序列數據庫（GISAID）公佈的2019-nCoV核酸序列，選取ORF1ab和N基因的保守區及人管家基因RNase P的保守區，採用Primer Premier 5.0軟件分別設計3套引物對和3條特異性探針，並使用Primer blast （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）進行評估。最終各基因分別確定1對引物和1條特異性探針，序列見表1（其餘引物對和探針未列出）。
（2）陽性標準品的製備根據全球流感序列數據庫（GISAID）公佈的2019-nCoV核酸序列製備WH(2020)和WH-nCoV-N及HRP病毒樣顆粒樣本，並進行梯度稀釋，採用數字PCR對標準品拷貝數進行標定和確認，將製備合格的標準品分裝並於-20℃保存備用。（3)實時熒光RT-PCR反應體系的建立採用10^5 U/L 熱啟動Taq酶、4×10^6 U/L c-MMLV酶、8×10^5 U/L RNasin、200 mM dNTPs、10 mM Tris-HCl (pH=8.3)、20 mM KCl、3.5 mM MgCl2配製預混反應液，與引物及探針進行熒光PCR體系配製，對引物和探針進行篩選，確認2019-nCoV各基因檢測引物和探針，再將各基因檢測引物和探針進行混合，配製成2019-nCoV多重實時熒光RT-PCR檢測反應體系，混勻後於ABI 7500熒光定量PCR儀進行擴增，反應條件為：50℃，15 min；95℃，15 min；94℃，15 s；55℃，45s；共45個循環。（4）準確性和重複性測試採用建立的多重實時熒光RT-PCR反應體系分別對5×10^6 copies/mL、5×10^4 copies/mL WH(2020)和WH-nCoV-N標準品進行批內和批間精密度試驗，每個濃度重複測試3次，採用SPSS 16.0 軟件計算Ct值的平均值、標準差和變異係數（CV），驗證該檢測體系的準確性和重複性。（5）靈敏度測試分別將已定值的WH(2020)和WH-nCoV-N標準品以10倍差進行稀釋，梯度濃度分別為1×10^6 copies/mL、1×10^5copies/mL、1×10^4 copies/mL、1×10^3 copies/mL、1×10^2 copies/mL，經優化好的多重實時熒光RT-PCR反應體系進行檢測，初步測試該方法的靈敏度範圍，再進一步測試確定靈敏度。（6）特異性測試使用優化好的多重實時熒光RT-PCR反應體系對2019新型冠狀病毒種屬相近或引起症狀相似的其他病原體樣本進行檢測，包括冠狀病毒OC43、NL63、229E、HKU1、副流感病毒、甲型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒，驗證該檢測體系的特異性。
二、結果及分析
1. 2019-nCoV檢測體系的建立及優化：（1）2019-nCoV單重實時熒光RT-PCR反應的建立：採用10倍差濃度梯度（1×10^8~1×10^4 copies/mL）的WH(2020)、WH-nCoV-N和HRP病毒樣顆粒提取的核酸作為檢測樣本分別篩選兩個目的基因及內參基因檢測引物探針。分別確定一套相對較優的引物探針組合體系（表1），具有明顯S形擴增曲線，且曲線光滑，Ct值較為合適，絕對熒光強度與背景熒光強度的差值（ΔRn）較大（圖1）。因此確定ORF1ab、N及內參基因擴增單重體系。
圖1 單重實時熒光 RT-PCR反應擴增曲線
（2）2019-nCoV多重實時RT-PCR反應的建立：將通過單重實時熒光RT-PCR反應篩選出的2019-nCoV ORF1ab和N基因檢測體系及內參基因檢測體系進行混合，以1×10^6 copies/mLWH(2020)、WH-nCoV-N和HRP病毒樣顆粒樣本提取的核酸為模板進行檢測，發現ORF1ab和N基因檢測通道的熒光值明顯高於內參基因檢測通道（圖2-A）。為了實現多重實時熒光RT-PCR中多個基因擴增效率的一致性，通過改變引物探針用量對多重實時熒光RT-PCR反應體系進行優化，最終獲得較好的多重實時熒光RT-PCR擴增體系（圖2-B）。
圖2 多重實時熒光RT-PCR反應擴增曲線
2. 2019-nCoV多重實時熒光RT-PCR檢測體系性能研究：（1）多重實時熒光RT-PCR反應體系的準確性和重複性：使用2.1.2建立的多重實時熒光RT-PCR反應體系分別對不同濃度的WH(2020)和WH-nCoV-N標準品進行批內和批間精密度試驗，每個濃度重複測試3次，統計計算批內和批間重複試驗Ct值的變異係數CV均小於5%，見表2和表3。
（2）多重實時熒光RT-PCR反應體系的特異性：通過Blast進行同源性分析，多重體系的引物探針與其他冠狀病毒和流感病毒等無同源性。使用2.1.2建立的多重實時熒光RT-PCR體系檢測冠狀病毒OC43、NL63、229E、HKU1、副流感病毒、甲型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、SARS冠狀病毒及MERS冠狀病毒核酸，同時以5×10^6 copies/mL的WH(2020)和WH-nCoV-N病毒樣顆粒提取的核酸為陽性模板，並設置空白對照，結果只有陽性模板有正常擴增曲線，其它均無擴增，表明該檢測體系具有較好的特異性（圖3）。
圖3 多重實時熒光RT-PCR反應特異性擴增曲線
（3）多重實時熒光RT-PCR反應體系的靈敏度：使用10倍差梯度濃度（1×10^6~ 1×10^2 copies/mL）的病毒樣顆粒提取的核酸作為模板進行多重實時熒光RT-PCR反應體系的靈敏度度測試，結果顯示，體系檢測1×10^2 copies/mL的樣本ORF1ab基因檢測通道（VIC）無熒光信號，N基因檢測通道（FAM）雖然存在熒光信號和擴增曲線，但Ct值為40.5，檢測1×10^3 copies/mL的樣本，ORF1ab 檢測通道（VIC）和N基因檢測通道（FAM）均存在明顯擴增曲線，且曲線形態良好（圖4）。因此，採用1×10^4 copies/mL、1×10^3 copies/mL、500 copies/mL、200 copies/mL病毒樣顆粒提取的核酸作為模板進一步測試，各進行20個重複測試，確定本研究建立的多重實時熒光RT-PCR體系的靈敏度為500 copies/mL（圖5）。
圖4 多重實時熒光 RT-PCR體系靈敏度測試擴增曲線
圖5 多重實時熒光RT-PCR靈敏度確定擴增曲線
冠狀病毒為不分節段的單股正鏈RNA病毒，易發生基因組的變異和重組，病毒顆粒呈圓形或橢圓形，直徑50～200nm，具有包膜，包膜上有類似日冕的刺突[19]。人冠狀病毒常引起呼吸道感染，該類病毒主要通過飛沫或直接接觸分泌物傳播，潛伏期一般為7天左右[19] ，因2003年出現的SARS病毒（SARS-CoV）導致感染者出現嚴重急性呼吸綜合徵而引起全球普遍關注。在SARS-CoV病毒發現後，又相繼發現6種引起呼吸系統疾病的HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、MERS-CoV冠狀病毒及新發現的2019-nCoV[4-8]，目前，β屬新型冠狀病毒2019-nCoV流行病學尚不完全清楚，針對該病毒建立核酸檢測方法，對疾病診斷和後期防控具有重要意義。
病毒的實驗室常用檢測方法主要包括病毒分離培養[20-21]、血清學檢測[22-23]及核酸檢測[24-28]。病毒分離培養雖然為病毒檢測的金標準，但存在檢測週期較長，且部分病毒培養陽性率較低的問題。血清學檢測存在靈敏度低、操作繁瑣等缺陷，不利於疾病的早期診斷和治療。核酸分子檢測具有較高的特異性及靈敏度，已廣泛應用於病毒包括冠狀病毒的臨床檢測，主要包括PCR[24]、實時熒光PCR[25-26]、芯片[27]及高通量測序技術[28]等。PCR需結合電泳法對擴增產物進行分析，存在耗時較長、操作麻煩且容易汙染等缺點。芯片技術雖然自動化程度高且檢測通量高，但其價格昂貴，且重複性差難以廣泛應用於臨床檢驗。高通量測序技術在檢測通量及挖掘病毒深層信息方面具有獨特優勢，然而，其數據分析難度高且價格昂貴等問題，大大限制了該技術在臨床方面的推廣及應用。而熒光PCR技術操作簡單、結果直觀、具備較高敏感度、特異性、準確性和重複性且檢測成本較低等優勢，已廣泛應用於臨床呼吸道病原體、腸道病原體及性病病原體等常見臨床感染性疾病的診斷，是我國新型冠狀病毒疑似感染者推薦的確診方式之一。
本研究根據全球流感序列數據庫（GISAID）公佈的2019-nCoV核酸序列，選擇ORF1ab和N基因兩個基因作為檢測靶標，對其保守區進行檢測，而目前市場上部分企業已建立的方法僅對ORF1ab基因進行檢測，相比較而言，本研究可對新型冠狀病毒的檢測進行雙重把控，檢測結果更為可信。同時，本研究建立的方法選擇人管家基因RNase P的保守區作為內參基因進行檢測，可對檢測中樣本的採集及核酸提取過程進行監控，可有效避免因樣本質量問題導致的假陰性結果的出現。然而，市場上大部分新型冠狀病毒相關核酸檢測產品並未採用人源性的內參基因對樣本質量進行監控，這可能是導致目前新型冠狀病毒核酸檢測陽性率低的重要原因之一。通過性能研究分析發現，本研究建立的2019-nCoV檢測試劑，靈敏度可達500 copies/mL，而已報道的傳統實時熒光PCR靈敏度為1000 copies/mL[29-30]，此外，目前市場上已公佈的2019-nCoV檢測產品大部分產品檢測靈敏度亦為1000 copies/mL，因此本研究建立的多重實時熒光RT-PCR體系在檢測靈敏度方面具有顯著優勢。檢測試劑的靈敏度是影響試劑盒檢測準確性的重要因素之一，靈敏度越高，低濃度樣本被正確檢出的幾率越高，則假陰性率越低。但靈敏度高的同時意味著特異性可能會受影響，如何在保證試劑具有較高靈敏度的同時，特異性能滿足臨床需求是衡量檢測試劑成功與否的重要指標。本研究建立的2019-nCoV多重實時熒光RT-PCR體系，在具有較高靈敏度的同時，經特異性分析發現具備良好特異性，與其餘6種冠狀病毒及其他呼吸道常見病原體均無交叉反應，其中SARS病毒與本病毒序列同源性達80%，亦能準確區分。因此，本研究所建立的多重實時熒光RT-PCR檢測方法具有特異性強、靈敏度高等優點，在檢測2019-nCoV時，採用人源性內標對樣本質量進行監控，是一種更為準確可靠的2019-nCoV病毒核酸檢測方法，可用於2019-nCoV的快速診斷，為新型冠狀病毒（2019-nCoV）的預防和流行病學研究奠定了基礎。
參考文獻略
來源：《臨床實驗室》2020年第2期“新冠病毒”專刊
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