CELL：髓母細胞瘤形成的祕密

北兒神外週刊

第29 期

神外前沿訊，1月23日，國際頂級學術期刊CELL（IF：36.216）發表了一篇關於髓母細胞瘤形成與生長機制研究的文章。

美國維吉尼亞大學Maojin Yao等研究人員的最新研究表明，星形膠質細胞的轉分化實現了髓母細胞瘤腫瘤生長所需的多細胞旁分泌反饋迴路，

神外前沿-北兒神外週刊在第一時間進行了要點編譯，並由北京兒童醫院神經外科主任葛明教授對編譯稿件學術審稿。

編譯全文

星形膠質細胞的轉分化實現了髓母細胞瘤生長所需的多細胞旁分泌反饋迴路

Astrocytic trans-Differentiation Completes a Multicellular Paracrine Feedback Loop Required for Medulloblastoma Tumor Growth

DOI: 10.1016/j.cell.2019.12.024

Source: https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)31386-8

摘要

腫瘤微環境（TME）對於腫瘤進展至關重要。然而，由於其複雜的細胞成分，TME的建立和作用仍然不清楚。通過使用稱為雙標記鑲嵌分析（MADM）的小鼠遺傳系統，研究人員描述了在SHH（sonic hedgehog）亞型髓母細胞瘤（起源於大腦中的單潛能顆粒神經元祖細胞）中，單細胞分辨率下TME的演化。首先，研究人員發現TME中的星形膠質細胞（TuAstrocytes）是從腫瘤顆粒神經元前體細胞（GNP）轉分化而來的，它們正常情況下不會分化為星形膠質細胞。其次，研究人員發現TME產生的IGF1促進腫瘤進展。第三，研究人員發現胰島素樣生長因子1（IGF1）是由腫瘤相關的小膠質細胞受白介-4（IL-4）刺激後產生的。最後，研究人員發現IL-4是由TME中的星形膠質細胞分泌的。總的來說，這項研究揭示了在髓母細胞瘤TME內產生多邊網絡的演變過程：一部分腫瘤細胞轉分化為腫瘤微環境中的星形膠質細胞，而後者又產生IL-4，刺激小膠質細胞產生IGF1，從而促進腫瘤進展。

腫瘤就像一個過度活躍器官。腫瘤細胞與腫瘤微環境以多種複雜方式相互作用以維持其生存首先，腫瘤微環境由多種細胞類型組成，包括血管成分，免疫細胞、以及其他組織原位細胞。其次，腫瘤微環境內的細胞間相互作用，形成腫瘤細胞賴以生存的環境。最後，腫瘤微環境與腫瘤細胞從最初到進展甚至完全惡性的過程呈動態一致發展。腫瘤微環境甚至可以在治療過程中重組，從而導致治療耐受。因此，解開腫瘤微環境的複雜性是勢在必行的：腫瘤微環境是如何建立以及多相複雜的腫瘤微環境中的細胞成分是如何相互作用導致腫瘤細胞進展。

實驗室人員採用了一種稱為雙標記鑲嵌分析（MADMs）的小鼠遺傳系統。MADMs利用Cre-loxP基因重組技術在雜合子小鼠中誘導染色體間有絲分裂重組產生少量綠色熒光蛋白（GFP）標記的細胞而此種細胞特定的腫瘤抑制基因（TSG）純合缺失，以及在體細胞中產生紅色熒光蛋白標記的野生型同種細胞。仔細篩選出腫瘤中表達但不在TME細胞中特異性表達的Cre基因，研究人員能夠從腫瘤最初發生到完全惡化的整個過程中研究GFP標記的腫瘤細胞與未受標記的TME細胞的募集，激活和組織網絡之間關係。

髓母細胞瘤是最常見的小兒腦惡性腫瘤，常見於發育中小腦，而SHH亞型髓母細胞瘤通常包含多種 TME細胞類型包括神經元，內皮細胞，小膠質細胞-巨噬細胞和星形膠質細胞。儘管髓母細胞腫瘤細胞在體內能進行無法控制地增殖，但很難使其在體外增殖，而是需要在免疫缺陷小鼠的腦中進行連續移植，來擴增髓母細胞腫瘤細胞。對於這一明顯矛盾的解釋可能是由於髓母細胞腫瘤細胞需要TME細胞信號賴以生存，而這在體外是缺乏的。

儘管髓母細胞瘤中星形膠質細胞成分起源尚不明確但卻是不良預後的相關因素。髓母細胞瘤腫瘤細胞起源於顆粒神經元前體細胞，是一種單潛能顆粒神經元祖細胞，只能分化為顆粒神經元。在小鼠模型中，研究人員使用特定作用於顆粒神經元前體（GNP）的Math1-Cre基因來標記腫瘤細胞使其突變，但其不作用於TME細胞。通過Math1-Cre報道基因對腫瘤GNPs特定標記進行體內分析，通過percol梯度離心技術將其高度純化進行體外分析。雜合Ptch1突變導致SHH通路信號上調導致導致腫瘤發生的極大風險，而P53基因缺失導致患者生存率低下且縮短小鼠模型中全外顯率腫瘤發生的潛伏期。

大腦是一個免疫豁免器官，小膠質細胞是基本組織原位巨噬細胞，腦特異性星形膠質細胞充當非專業免疫細胞，這提供一個相對簡單的系統來解釋不同細胞之間的相互作用。研究人員為髓母細胞瘤創建了一個基於MADM的小鼠模型，通過該模型發現了一個複雜的TME多邊網絡，該網絡是通過轉分化和多邊旁分泌信號傳導形成。

基於MADM及其他遺傳模型的髓母細胞瘤系統建立

為了研究不同TME細胞對於SHH亞型髓母細胞瘤（以下均將SHH亞型髓母細胞瘤稱髓母細胞瘤）作用，研究人員建立了基於MADM的遺傳模型，在Ptch-1（+/-）雜合子，P53(+/-)雜合子小鼠中利用Math1-Cre基因技術產生Ptch-1（+/-）雜合子，P53（-/-）缺失和GFP+ 的GNPs。Math1-Cre基因能準確標記GNPs，而不是潛在的TME細胞類型。

除了基於MADM的模型之外，在這項研究中，使用了另三種稍加修改的小鼠模型來解決某些特定問題。在模型B中，Math1-Cre和Cre報道基因用於使GNP中特定基因失活，以至分化為其他細胞類型後仍能追蹤腫瘤譜系。在模型C中，Math1-GFP被用作標記腫瘤細胞，以將其與TME細胞區分；在模型D中，未攜帶Cre基因的髓母細胞瘤模型使研究人員能夠在特定的時間或在特定所需的TME細胞類型中植入Cre基因來進行功能分析。所有這些都是具有完整免疫系統的遺傳模型，並且沒有腫瘤移植模型中常見的損傷相關的併發症。

隨著腫瘤進展的TME細胞的逐步積累以及來源於腫瘤細胞的星形細胞樣細胞的轉分化發現腫瘤組織免疫熒光分析表明MADMs模型的各個階段都存在人髓母細胞瘤中觀察到的所有類型的TME細胞（圖1H-1J）。不同的TME細胞以不同的速度生長。隨著腫瘤的進展CD31+內皮細胞也在增加（圖1H'），IBA-1+ 腫瘤相關小膠質細胞或巨噬細胞(TAM)及膠質原纖維酸性蛋白(GFAP) +星形膠質細胞在腫瘤發病初期急劇升高,然後穩定持續存在(圖1 I'和J'）。

小膠質細胞和星形膠質細胞是很少出現在正常外顆粒層(EGL)，外顆粒層正是腫瘤起源的部位（圖1I'和J'，第一條）。正因為其突然和豐富的存在而且甚至在最小的腫瘤中也如此，對於提示腫瘤惡性程度非常關鍵。與正常腦區(圖1H-1J和1N)相比，腫瘤區血管腔增大(圖1H)， I BA-1+細胞衍生物減少(圖1I)，腫瘤組織GFAP+表達升高(圖1J)，提示TME細胞與腫瘤細胞共同進化。

在每個檢查的腫瘤中，腫瘤組織中所有星形膠質細胞(GFAP+)都是GFP+(圖1M)。確定Math1-Cre對GNPs進行了準確的標記，而不是正常星形膠質細胞，這表明髓母細胞瘤中GFAP+GFP+細胞很可能是TuGNPs來源的，而不是正常的星形膠質細胞(腫瘤GNPs以下簡稱TuGNPs)。

除GFAP以外，星形膠質細胞的另一標記物腦脂結合蛋白（BLBP），顯示出與GFP重疊的染色（圖S1F和S1F'）。BLBP + GFP +細胞被限制在腫瘤區域，但在相鄰的正常區域中從未被發現（圖S1F'與圖S1F''）。

研究人員建立了一個髓母細胞瘤模型，其中GNP譜系用tdTomato標記(模型B)，星形膠質細胞用星形膠質細胞特異性的Aldh1L1-GFP細菌人工染色體(BAC)轉基因標記。觀察到GFP和tdTomato在這些細胞上共同表達(圖S1G)進一步支持了這些TuGNP來源細胞的星形膠質細胞特性。

最後，還注意到這些GFAP+細胞與正常星形膠質細胞有顯著的形態相似性。在正常小腦中進行Bergmann膠質細胞的表型複製（圖1N）， GFP+ GFAP纖維的放射狀排列在早期至中期腫瘤的邊緣高度明顯(圖1O和圖1P)。此外，GFP標記的星形膠質細胞樣細胞與整個腫瘤區域的血管緊密相關（圖1Q和1R）。綜上所述，MADMs提供的細胞分辨率不僅揭示了TME細胞在腫瘤進展過程中的協同進化過程，還意外發現了TuGNPs向星形膠質細胞的潛在轉分化。

圖1（H和H’）腫瘤相關血管的內腔大於鄰近的正常組織血管內腔（N）。與正常的EGL相比，隨著腫瘤的進展，血管生長逐漸增加（n=3、4、4和3）。（I和I’）EGL中含有很少小膠質細胞，但卻隨著腫瘤進展明顯增多（n=3）。（J和J’）EGL中不存在星形膠質細胞，但在腫瘤中明顯存在（n = 3）。（K-M）血管（K）和小膠質細胞（L）均不表達GFP。與之形成鮮明對比的是，腫瘤（M）中的所有GFAP +細胞均為GFP+。(N)在正常小腦中，GFAP+Bergmann膠質細胞呈擴張放射狀通過分子層（ML）（虛線勾畫）。（O）在腫瘤的病灶區域可以發現相似的GFAP+放射狀組織過程（虛線勾畫）。（P）（0）中框形區域的放大。（Q和R））腫瘤來源的星形膠質細胞（GFP+GFAP+）與血管（CD3+）密切相互作用，通常包裹整個血管（R；Q中方框區域的放大更高倍率）。

圖S1 (F) GFP +星形膠質細胞僅存在於腫瘤（F'）中，而不存在於無腫瘤的腦區域（F’’）中。(G)一種小鼠髓母細胞瘤模型，其中所有來自GNP的細胞譜系均為tdTomato +，而星形膠質細胞被Aldh1L1-GFP標記。如果腫瘤相關的星形膠質細胞來自腫瘤細胞，則它們應顯示為黃色（Aldh1L1-GFP +和tdTomato+）。

來源於TuGNPs的星形膠質細胞轉分化及其與人類是否存在相關性

研究人員排除了觀察到的轉分化的其他解釋。首先雖然Math1-Cre可以準確標記正常大腦中的GNPs，但Mathl啟動子在星形膠質細胞被募集到腫瘤後可能被錯誤激活，此次MADM的雙色設計很容易排除了這種可能性，啟動子洩漏會導致黃色星形膠質細胞，而這種現象在所有腫瘤中都從未見過。其次在分別檢查了10個腫瘤的1000多個BLBP+GFP+細胞，從未觀察到雙核細胞，星形膠質細胞與GFP標記的TuGNPs之間的細胞融合的可能性被排除了。

以防細胞融合後細胞核融合形成單核融合細胞，研究人員建立了一個髓母細胞瘤模型，其中所有GNPs都用GFP標記（模型D），所有星形膠質細胞都用tdTomato標記，觀察是否黃色星形膠質細胞生成。在對4只荷瘤小鼠中檢查了100多個tdTomato +細胞後，未觀察到黃色TME星形膠質細胞，這明確排除了細胞融合的可能性。在模型C中，即使所有腫瘤細胞均使用Mathl-GFP標記，但所有星形膠質細胞均為GFP陰性(數據未顯示)，排除了GFP蛋白從TuGNPs轉移到星形膠質細胞的可能性。

為了更明確地確定這些“星形膠質細胞樣”細胞的身份，採用激光捕獲顯微切割(LCM)及RNA測序技術分析了它們的轉錄組。不進行免疫染色的情況下可視化腫瘤組織中的靶細胞，使用了一種小鼠模型，其中TuGNPs為紅色，腫瘤來源的星形膠質樣細胞為黃色，正常星形膠質細胞為綠色（模型B）。對組織處理程序進行了廣泛優化之後，避免未固定組織中熒光蛋白的擴散損失，從每個腫瘤樣本中收集了約250個星形細胞樣細胞。在提取RNA，擴增cDNA，並確認LCM收集的星形膠質樣細胞，TuGNPs和正常小腦星形膠質細胞的純度後，進行了RNA測序，後進行無監督聚類轉錄組分析（每個n = 4）。研究人員發現星形膠質細胞樣腫瘤細胞比起TuGNPs更傾向正常星形細胞聚集(圖2C)。在星形膠質細胞樣細胞中，幾乎所有TuGNPs特異性轉錄物均下調（圖2C，頂和2D，底），而許多星形細胞特異轉錄物上調（圖2C，底部和2D，頂部），表明廣泛的轉分化。由於星形細胞樣細胞與正常星形細胞在約2500個獨特表達的轉錄物(圖2C，中心)中極為相似，但仍有差異，稱為“腫瘤微環境星形膠質細胞（TuAstrocytes）”。

最終，運用兩種方法來調查長期存在於髓母細胞瘤中的星形膠質細胞成分是否來源於TuGNPs。第一種方法，使用了原代SHH亞型髓母細胞瘤，將其連續異種移植到患非肥胖型糖尿病（NOD）/嚴重聯合免疫缺陷（SCID）小鼠腦中，並通過沿代基因表達譜進行驗證。能觀察到所有被檢測的異種移植腫瘤中有人類GFAP特異性免疫反應（圖S2J）。因為這些腫瘤細胞已通過多次傳代移植來消除非腫瘤細胞，所以這些人類GFAP +細胞最有可能從TuGNPs分化而來。

第二種方法，通過對PTCH1（9q22.33）和相鄰位點（9q21.33）行雙色熒光原位雜交（FISH）及GFAP免疫熒光染色，評估了腫瘤內每個星形膠質細胞的染色體完整性。為了確保這些患者不是這種核型異常的種系攜帶者，混淆數據，先行證實腫瘤組織中大多數內皮細胞具有正常的核型（圖2F）。在6例病例中有6例（圖2H），GFAP +細胞具有與腫瘤細胞同等水平的單等位基因PTCH1-9q21.33丟失（圖2G），這表明這些星形膠質細胞與有著同樣遺傳損傷腫瘤細胞具有相同的譜系。在詳細的驗證了所有可能的替代解釋之後，我們得出結論，TME中的星形膠質細胞（TuAstrocytes）來自於小鼠模型和人髓母細胞瘤患者中的TuGNPs。

圖2（C）TuGNPs，正常星形膠質細胞和TuAstrocytes的RNA-seq數據的層次聚類分析。（D）許多星形細胞標記物在TuAstrocytes中升高，而特異性TuGNP基因卻降低。

圖2（F）內皮細胞（CD31+）具有正常的核型（兩個紅色的FISH信號，帶有星號的細胞在右側被放大），而周圍的腫瘤細胞只有一個紅色的信號（箭頭），表明丟失了一個含PTCH1的染色體片段。（G）在GFAP+細胞中（右側為放大了的帶有星號的細胞）從9q21.33區域到PTCH1位點丟失了一個等位基因，與周圍的腫瘤細胞一致（箭頭）。（H）定量分析顯示，六個患者樣品中的大多數TuGNP和TuAstrocytes均具有相同的異型。

圖S2（J）連續異種移植的SHH亞型人類髓母細胞瘤細胞（此處顯示第12代）產生的分散細胞具有星形細胞形態，在整個腫瘤中對人GFAP蛋白染色呈陽性，這表明人類髓母細胞瘤腫瘤細胞的轉分化活性可以長期維持。

星形膠質細胞似乎支持腫瘤進展

GFAP不僅是星形膠質細胞的標記基因，也是神經幹細胞的標記基因。由於無法純化活的TuAstrocytes（數據未顯示），研究人員建立了一類小鼠髓母細胞瘤模型，其中在他莫昔芬注射後用RFP標記TuAstrocytes（模型D），如果TuAstrocyte能起腫瘤幹細胞的作用，在較長時間後能找到RFP + TuGNPs 。然而，在他莫昔芬注射後2周沒有觀察到紅色的TuGNPs（圖3B）。以防需要更多的時間來使TuAstrocytes產生TuGNPs，研究人員將來自該模型的未標記原發腫瘤移植到NOD-SCIO小鼠中，在腫瘤開始生長後給予他莫昔芬治療，2個月後仍未觀察到任何RFP + TuGNPs（圖3C），所以並不支持TuAstrocytes表現出腫瘤幹細胞的作用。

研究人員在出生後35天（P35）的Ptch-1(+/-)小鼠中的小腦表面識別了癌前病變（PNL）之後，評估了星形膠質細胞總量與GNPs增殖狀態之間的相關性（圖S3A和S3B）。在30多個PNLs中，發現星形膠質細胞的存在與GNP增殖密切相關，反之亦然（p <105,Fisher檢驗；圖S3C），表明星形膠質細胞可能在癌前病變（PNL）進展中起重要作用。

其次，當在體外培養純化的TuGNPs時，研究人員觀察到分散的細胞迅速停止增殖，但那些聚集的細胞卻顯示出強大的增殖能力（圖S3D）。為了研究TuAstrocytes是否參與，研究人員從用於LCM實驗的Aldh1L1-GFP模型中製備了RFP + TuGNPs（圖S2E，模型B）。儘管最初所有的細胞都是紅色的，但在培養的第3天，GFP + TuAstrocytes開始出現聚集（圖S3E和S3G），並在第6天出現大幅度增加（圖S3F和S3G）。這表明在培養中自發的TuGNPs到TuAstrocytes轉分化和球形擴張形增加同時存在，兩者合計得出結論，TuAstrocytes不是腫瘤幹細胞，而是很可能對TuGNPs起支持作用。

圖3(B) 他莫昔芬注射後2周後TuAstrocytes未產生TuGNPs。(C) 即使2個月後，TuAstrocytes也未產生TuGNPs。

圖3S（A-C）在PNL中，TuGNPs的增殖與TuAstrocytes的存在密切相關。（E-G）TuAstrocytes（Aldh1L1-GFP+）逐漸出現在腫瘤球形細胞團

IGF1是支持腫瘤生長的TME因子

通過測試一組已知的對大腦發育和腫瘤進展很重要的八種生長因子來檢驗TuAstrocytes如何促進腫瘤進展。首先，運用qRT-PCR技術來比較它們在腫瘤和正常腦中的表達水平，並假設候選因子應該在腫瘤中始終以更高的水平表達，確定了三種候選因子：胰島素樣生長因子1（IGF1），肝細胞生長因子（HGF）和血小板源性生長因子A（PDGF-A）在腫瘤中始終表達2倍甚至更高水平。為了區分是TME來源還是腫瘤內在因素，分別在腫瘤組織和純化的TuGNPs上對這三種因子做配對qRT-PCR。發現IGF1和HGF是來源於TME，而PDGF-A卻不是且IGF1而非HGF以劑量依賴性方式促進細胞培養中TuGNPs的增殖。

建立了小鼠模型驗證，其中IGF1受體（IGF1R）在GNPs中被特異性地進行基因刪除（模型C加上IGF1R-flox等位基因，以下稱為胰島素生長因子1受體條件性基因敲除（IGF1R-CKO））。發現與同一階段的對照組相比，IGF1R-CKO小鼠的腫瘤要小得多。IGF1R-CKO小鼠的存活時間比IGF1R-野生型(IGF1R-WT)和IGF1R-雜合小鼠長得多。在研究終點（P130）進行腦組織學檢查，在IGF1R-CKO小鼠腦中只發現少量腫瘤細胞，這表明IGF1R信號傳導在髓母細胞瘤中起著不可或缺的作用。

由於Math1-Cre在GNP的整個發育過程中表達，因此該模型中無法形成腫瘤可能是由於IGF1R失活時所致GNPs發育缺陷所致。為了排除這種可能性，建立了另一種小鼠模型，其中IGF1R缺失是由他莫昔芬依賴性Math1-CreER介導的（圖4H，模型D）。確認他莫昔芬對腫瘤進展無影響後，腫瘤形成後（P40）注射他莫昔芬使TuGNPs上的IGF1R失活。與其對照組相比他莫昔芬處理過的小鼠中的腫瘤更小（圖4I和4J），表明了在TuGNPs中IGF1信號的急性失活減緩了腫瘤進展。

為了探究腫瘤縮小的原因，研究人員進一步檢查了TuGNPs的凋亡指數和細胞週期退出指數，發現與IGF1R-WT TuGNPs相比，IGF1R缺失的TuGNPs更容易死亡和退出細胞週期（圖S4G-S4I）。這些數據表明，TME來源的IGF1信號傳導不僅對髓母細胞瘤的發生而且對於持續進展都至關重要。

圖4（H-J）在腫瘤發生後建立IGF1R失活髓母細胞瘤模型；他莫昔芬（150 mg / kg）誘導的腫瘤GNPs中IGF1R的失活抑制了腫瘤的進展（每組n = 8）。

圖4S（G-I）與對照組相比，他莫昔芬治療組的凋亡細胞更高。 與對照組相比，他莫昔芬治療組中有更多的細胞退出細胞週期（BrdU + Ki67-）。

IGF1是由TAMs分泌的，而不是由TuAstrocytes分泌的

因為TuAstrocytes是由TuGNPs轉分化而來，研究人員建立了一個互補的小鼠模型，用Math1-Cre（模型C加IGF1-flox等位基因）使IGF1失活，IGF1基因敲除（KO）模型未能減慢腫瘤的進展，懷疑TuAstrocytes可能不是IGF1的細胞來源。

RNA原位雜交檢測IGF1及免疫熒光染色檢測細胞類型，發現IGF1是由IBA-1 +腫瘤相關髓系細胞（TAMs）特異性產生，而不是TuAstrocytes（圖5A和5B）。雖然約70％的TAMs是IGF1 +，但在正常腦區（正常vs腫瘤區，圖5A，中部；在圖5C中量化）的小膠質細胞中未檢測到IGF1。

親和純化TAMs和小膠質細胞後，進一步通過qRT-PCR確定了TAMs中IGF1的表達水平比正常小膠質細胞高出一個數量級（圖5D）。共培養純化TAMs和TuGNPs表明，TAMs以密度依賴性方式促進TuGNPs增殖，且主要依賴於IGF1。

建立另一個髓母細胞瘤模型，其中IGF1被髓系特異性CSF1R- Cre將其失活（圖5H，模型D）。發現在出生後35天小鼠（P35）中特異性刪除IGF1的TAMs與IGF1-WT相比腫瘤更小（圖5I和SJ，n> 1O），表明TAMs來源的IGF1在腫瘤的發生起支持作用。

圖5 (A和B)原位雜交顯示IGF1是由IBA1 +TAMs產生，而不是由正常的小膠質細胞產生的。低倍率（A）和高倍率（B）。(C)產生IGF1的IBA1 + TAMs的比例（n = 4）。(D)qRT-PCR比較經快速純化的小膠質細胞和TAMs中IGF1表達水平。（H）敲除TAMs上IGF1的髓母細胞瘤小鼠模型。

TAM是局部激活的小膠質細胞，而不是循環單核細胞來源的巨噬細胞

為什麼大多數TAMs表達IGF1但卻很少的正常小膠質細胞表達IGF1？一種可能的解釋可能是它們的不同起源。小膠質細胞源於胚胎卵黃囊，並受大腦環境影響而形成，與循環單核細胞來源的巨噬細胞本質上是不同的因此，TAMs中IGF1表達的升高可能意味著TAMs來自循環單核細胞來源的巨噬細胞，尤其是因為我們注意到TAMs的形態與原位小膠質細胞極度不同。

研究人員使用譜系追蹤方法，以區分小膠質細胞與單核細胞來源的巨噬細胞，最初標記的單核細胞將因幹細胞的快速更新而被幹細胞來源的未標記的單核細胞所替代，而小膠質細胞則由於其緩慢而局部的補充而仍會被標記。為了避免在腫瘤早期被標記的單核細胞無法更新這種微小可能性，在小鼠生後7天（P7）即腫瘤發生很久前注射他莫昔芬。在P40腫瘤還很小時檢查腦組織，在P60時腫瘤完全進展時再次檢查，我們發現腫瘤所有TAMs都被tdTomato標記，表明它們起源於小膠質細胞（圖6B-6 E）。

繼續對純化的TAMs進行RNA測序（RNA-seq）分析及層次聚類分析表明，與循環單核細胞來源的巨噬細胞相比，TAMs與小膠質細胞的轉錄組相似性更高（圖6F和6G）。TAMs與正常的小膠質細胞相比，基因表達發生了顯著變化，並且與正常的小膠質細胞之間的差異比脂多糖（LPS）處理的小膠質細胞相比更大（圖6G），表明局部TME因子對其影響很大。

除了小膠質細胞外，最近的一篇論文還報道了腦膜巨噬細胞的更新也很慢，這也可能是標記TAMs的一個來源。葡聚糖染色標記腦膜巨噬細胞，在第3天及第7天時檢測均未發現浸潤，表明腦膜巨噬細胞不太可能是TAMs的主要來源。綜上所述，這些數據表明TAMs起源於小膠質細胞，並經歷可能由TME因子誘導的顯著形態和功能變化。

圖6（B和B’）TdToma+TAMs存在於小型腫瘤中（虛線標出，n = 3）。（C-E）在成熟腫瘤中tdTomato+TAMs大量存在於Math1-GFP +腫瘤組織。低倍率（C），高倍率（D）和量化（E）。（F）本研究與Bennettet等人（2016）發表的數據組之間的P60小膠質細胞的轉錄組學數據皮爾森相關係數表明這兩組數據高度相關。

IL-4信號負責通過刺激TAMs提高IGF1表達

因為TAMs起源於通常不表達高水平IGF1的小膠質細胞，研究人員提出了以下假設：TAMs中IGF1表達是由TME因子誘導的免疫狀態改變引起的。首先對TAMs的RNA-seq數據進行了全面的生物信息學分析，將其與正常小膠質細胞對比，重點放在致耐受特徵基因上，此前已證明其可促進腫瘤發生，在4,898個上調的基因和4,521個下調的基因中，發現了總體致耐受特徵，包括傾向於產生IL-10，對適應性免疫的負調控，對炎症反應的負調控，及與Th2免疫相關的因子以及IL-4介導的信號傳導。

研究巨噬細胞/小膠質細胞中已知誘導IGF1的兩條通路：IL-4和腫瘤壞死因子α。Luminex（多功能液相芯片分析技術）分析所得數據：IL-4通路中的基因在TAMs中普遍升高，尤其是那些依賴STAT6引發的基因（圖7A）。觀察到在巨噬細胞中由IL-4相關激酶調控的差異表達基因顯著增加，包括JAK2和ERK1-ERK2。相反，已知由TNF-a刺激巨噬細胞誘發的基因通常被下調，包括依賴於TNF-a通過核轉錄因子KB（NF-KB）和AP1信號傳導的基因（圖7B，藍色條），而被TNF-a抑制的基因卻被上調（圖7B，紅色條）。表明腫瘤中IL-4升高，但TNF-a卻沒有。

為了研究其功能相關性，純化腫瘤中TAMs，發現在IL-4刺激後IGF1表達的明顯增高（圖7D）。在一項補充實驗中，建立了具有無IL-4背景下小鼠髓母細胞瘤模型（圖S7C，模型C）。儘管IL-4 KO不會改變腫瘤中TAMs的數量（圖S7D），但卻明顯導致腫瘤中IGF1表達降低（圖7F）。因此，這組實驗表明，IL-4對於促進TAMs中IGF1表達是充分必要的。

圖7 （A-B）對TAMs中差異表達基因的通路分析顯示，與IL-4相關的信號顯著上調（A），但TNF-a信號卻沒有（B）。（D）IL-4刺激快速純化TAMs導致培養中IGF1水平升高。（F）IL-4 KO導致腫瘤中IGF1表達水平降低。

圖S7（C）原位雜交顯示在IL4 KO荷瘤小鼠中不能檢測到IL4 mRNA，證實了基因敲除的有效性。（D）對IBA 1進行免疫熒光染色顯示，IL4野生型和IL4 KO腫瘤中TAMs細胞密度相似。

IL-4由TuAstrocytes產生

已知IL-4的主要來源於Th2淋巴細胞，所以在使用PBS緩衝液進行心內灌注仔細去除血液中的免疫細胞後對TME中的免疫細胞類型進行全面分類。數據表明，髓母細胞瘤中98％以上CD45 +免疫細胞是髓系標記CD11b陽性（圖7G）。考慮活化T和B淋巴細胞和成熟的自然殺傷（NK）細胞中CD11b表達的可能性，對T細胞（CD3），B細胞（CD19）和NK細胞（NK1.1）進行了進一步的流式細胞術分析。該分析未發現對腫瘤中的T淋巴細胞標記CD3的免疫染色（圖S7E和S7F），表明腫瘤中僅存在少量的T，B和NK細胞。綜上所述，由於缺乏T細胞浸潤，研究人員推測IL-4不是來源於Th2淋巴細胞而是一定是TME細胞。

進一步對IL-4進行了原位分析檢測，並對細胞類型特異性標記物進行了免疫染色。確定了GFAP +星形膠質細胞是IL-4的主要來源（圖7I和7 I'）。為了研究IL-4是由正常星形膠質細胞還是由腫瘤來源的星形膠質細胞產生，研究人員建立了一個小鼠模型，該模型包含了腫瘤譜系標記（tdTomato）和IL-4-GFP報道基因（模型B）。發現所有IL-4-GFP +細胞上均表達GFAP和tdTomato，這表明IL-4是由TuAstrocytes而不是正常星形膠質細胞特異產生的（圖7J和7K）。

圖7 （I和I’）原位雜交技術顯示IL-4是由腫瘤組織中GFAP +細胞產生的。(J)所有的lL4-GFP+細胞均為tdTomato+和GFAP +，表明IL-4的分泌是由TuAstrocytes產生的。(K)量化分析表明，IL-4在50％的TuAstrocytes中表達，但在正常的星形膠質細胞或TuGNPs中不表達。

圖S7（E和F）CD3免疫熒光染色顯示在腫瘤中沒有檢測到T細胞。

討論

通過全面的譜系追蹤，分子分析和功能研究，我們證明了髓母細胞瘤中的TME成分形成促進腫瘤進展的複雜網絡（圖7L）。要開發針對TME的新型腫瘤治療策略，必須深入研究TME的建立和功能，尤其要注意時間，空間，細胞譜系以及同型和異型細胞之間的相互作用。

MADMs系統提供空間分辨率以降低TME的複雜性

MADMs系統利用其譜系追蹤能力來發現腫瘤與TME之間的關係。這種相互作用的複雜性可以從表面上看似“簡單”的腫瘤上揭示出來，進一步強調在更復雜的腫瘤中解開TME內在功能的重要性。

TuGNPs向TuAstrocytes轉分化：腫瘤中的通路建立行為

對人髓母細胞瘤樣本進行核型分析證明了在腫瘤組織中腫瘤GNP與星形膠質細胞樣細胞成分之間的譜系關係。此次研究新穎性在於兩個方面。首先，從GNP向星形膠質細胞的轉分化必須克服發育程序中的重大障礙，因為GNP池和產生星形膠質細胞的神經幹細胞池在時間（從小鼠胚胎髮育的第9.5天[E9.5]開始）及空間上（GNP駐留在小腦原基表面的EGL中，而神經幹細胞（NSCs）駐留在腦室區，即在第四腦室的神經管的最內層）是分離的。其次，儘管在這項研究中揭示了轉分化TuAstrocytes功能作用，但是還有待觀察其他腫瘤類型中的轉分化的細胞是否也起著如此重要的作用。

儘管如此，仍有許多未解決的問題。首先，轉分化的機制什麼？第二，在整個腫瘤進展過程中如何維持約1％的TuAstrocytes成分？最後，儘管我們觀察到TuAstrocytes直接支持腫瘤進展的提示，但我們的研究卻意外地轉向了TuAstrocytes，TAM與腫瘤細胞之間網絡的發現。將來，重要的是研究TuAstrocytes對腫瘤細胞的直接支持因子，並探討它們在維持血腦屏障（BBB）方面的作用，因為SHH亞型髓母細胞瘤與Wnt亞型形成鮮明對比的是前者幾乎沒有血腦屏障（BBB）破壞。

雖然研究發現了在髓母細胞瘤中由TuAstrocytes和小膠質細胞形成的抗炎免疫網絡，然而在其他情況下，小膠質細胞和星形膠質細胞相互激活以建立促炎環境。

除了激活大腦的先天免疫系統之外，將適應性免疫細胞引入腦實質中可以促進腦腫瘤的治療。此次建立的髓母細胞瘤模型中很少發現T，B或NK細胞，這與先前人髓母細胞瘤樣本中的發現一致。並且當T細胞到達腫瘤時，T細胞的關鍵細胞因子，例如IL-2和IL-15在我們的髓母細胞瘤模型中也都過低，以至無法支持其生存。這一發現與最近的臨床研究所表明的相吻合，細胞毒性T細胞的存在與髓母細胞瘤患者的總體生存率無關，並且神經膠質瘤中T細胞的耗竭極為嚴重。

大腦對化學物質和電信號失衡極為敏感，並且可能因為細胞因子風暴或其他明顯的免疫反應而受到嚴重損害。因此，只有牢固掌握了神經免疫學知識之後，才能證明基於T細胞的免疫療法在腦腫瘤中的有效性。

通過多邊旁分泌迴路瞭解腫瘤的內在穩定性，制定有效的治療策略

儘管詳細的分子機制值得進一步探討，但清楚地揭示了髓母細胞瘤中TME網絡的複雜性未得到充分認識。研究數據表明不是一對一的TME-腫瘤串擾影響，而是揭示了一個錯綜複雜的TME網絡，轉分化和多邊旁分泌支持腫瘤細胞的生長。

雖然這項研究的重點是髓母細胞瘤的SHH亞型，但它展示了一個強大的生物技術平臺，可用於研究其他腫瘤類型的TME網絡。加深對TME與腫瘤細胞之間關係的理解，為切斷多邊旁分泌的串擾，從基礎上轉變破環腫瘤生長的傳統的治療策略帶來了巨大希望。

編譯作者

鄺蘇慧，現就讀於國家兒童醫學中心-首都醫科大學附屬北京兒童醫院，碩士-專業方向為神經外科。

編譯審稿

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