蛋白質分泌是細胞之間進行信息傳遞的核心方式之一。我們通常所指的分泌蛋白具有N端的信號肽序列，能夠被信號識別顆粒（SRP）所識別並通過SEC61轉運體（translocon）進入內質網腔，隨後信號肽被切除，分泌蛋白經過加工和修飾，通過內質網-高爾基體（ER-Golgi）膜泡運輸途徑被運送到細胞外，該過程被稱為經典分泌途徑[1-3]，其關鍵內容已經被寫入細胞生物學教科書。
近年來研究發現，許多蛋白質的分泌不依賴於ER-Golgi的常規分泌途徑，稱為非經典分泌（Unconventional Protein Secretion, UPS）[4,5]。大多數UPS蛋白不具有典型的信號肽，其分泌主要通過兩種方式：(1)直接穿越細胞質膜（I型）[6,7]; (2)類似於經典分泌，需要膜泡運輸介導（III型）[8,9]。在III型UPS中，蛋白質需要進入一個膜泡載體（例如分泌性自噬體和溶酶體等），然後通過膜泡運輸系統被運送到細胞外。由於缺少信號肽的導向，一個亟待解決的關鍵問題就是這類UPS貨物是如何進入膜泡載體中的。
2020年4月8日，清華大學生命科學學院葛亮課題組在Cell雜誌在線發表題為"A translocation pathway for vesicle -mediated unconventional protein secretion"的研究論文，報道了一條介導UPS貨物進入膜泡的蛋白跨膜轉運分子通路。
促炎症因子IL-1β (interleukin-1β)是第一個被發現，同時也是研究最多的非經典分泌蛋白[10]。IL-1β可通過I型和III型UPS分泌：I型途徑中，IL-1β主要通過Gasdermin D（GSDMD）N末端片段在細胞質膜上形成的孔被釋放[11-13]；III型途徑中，成熟型IL-1β (mIL-1β)被會運送到一個膜泡載體中[14-18]。在之前的研究工作中，作者建立了一套分析mIL-1β分泌的細胞學系統，發現mIL-1β能夠轉運進一箇中間膜泡結構並進入自噬體的雙層膜結構之間，最終通過分泌型自噬被分泌到胞外，並且這一跨膜轉運過程依賴於蛋白質的去摺疊[17]，這預示著存在一個類似translocon的膜通道（圖1）。
圖1. IL-1β進入膜泡載體並通過分泌型自噬被分泌
該工作中作者為鑑定這個未知的通道蛋白，採用二氫葉酸還原酶（DHFR）系統，並結合了蛋白質交聯和質譜技術。由於氨基蝶呤（aminopterin）抑制DHFR的去摺疊，摺疊形式的DHFR會像塞子一樣將mIL-1β-flag-DHFR阻滯在膜轉運機器上。之後通過化學交聯與免疫沉澱富集轉運機器並通過質譜進行鑑定，找到了一個膜蛋白TMED10（圖2）。細胞學研究發現TMED10調控mIL-1β的分泌。在CLP誘導的敗血性休克（Cecal Ligation and Puncture (CLP)-induced septic shock）小鼠模型中，TMED10髓系敲除的小鼠分泌更少的mIL-1β, 進而導致更低的炎症反應與更高的存活率，提示TMED10在某些生理條件下調控炎症因子的釋放和炎症反應。
圖2. 鑑定未知轉運體策略
有趣的是除了IL-1β外，非經典分泌蛋白IL-1家族其它成員（包括：IL-1α、IL-18、IL-33、IL-36、IL-37和IL-38）以及分子伴侶（HSP5B）、糖鏈結合蛋白（galectin 1和galectin 3）、 磷脂結合蛋白（Annexin A1）和神經毒性蛋白（Tau）的分泌也受TMED10調控，提示TMED10調控一系列UPS蛋白貨物的分泌。鑑於多種非經典分泌蛋白直接受TMED10的調控，一個重要的問題是否存在一個類似於經典分泌信號肽的共同序列調節這些UPS貨物的分泌？通過序列比對，作者發現了一個共同的基序motif1對這些UPS蛋白的分泌不可或缺， 提示motif1可能是一個通用的TMED10介導的非經典分泌信號序列。
為了研究TMED10是否是個蛋白轉運體，作者建立了體外脂質體重建實驗系統，發現UPS貨物能夠轉運進入含有TMED10的蛋白脂質體，並且轉運過程依賴於UPS貨物的motif1和蛋白質去摺疊。這提示TMED10具有直接轉運UPS貨物進入膜泡的活性，可能是一個通道蛋白。除此之外，作者也發現分別位於細胞質和內質網腔內的兩個分子伴侶蛋白HSP90A和HSP90B1（GRP94）促進TMED10介導的蛋白跨膜轉運，提示TMED10和這兩個膜泡內外分子伴侶蛋白協同轉運UPS貨物進入膜泡。
免疫熒光和電鏡結果顯示UPS貨物與TMED10在細胞內共定位於ERGIC (ER-Golgi intermediate compartment)。雙分子熒光互補(Bimolecular Fluorescent Complimentary, BiFC) 實驗顯示TMED10與mIL-1β處於相同的膜泡結構。這些結果表明，TMED10可能通過在ERGIC上形成一個通道介導UPS貨物進入膜泡載體ERGIC。
然而，TMED10是一個單次跨膜蛋白，要形成通道，就需要發生寡聚化。作者發現UPS貨物大量產生時導致TMED10自身發生寡居化，而隨著分泌的完成TMED10寡聚體逐漸解聚。這提示TMED10轉運體的形成和其介導的UPS貨物分泌是一個受貨物調節的過程，在貨物大量產生的時候被激活。
基於以上的實驗結果，作者提出了一個TMED10介導的非經典分泌途徑模型並命名為THUPS (TMED10-channeled UPS)：當需要分泌的UPS貨物（例如炎症反應中大量產生的mIL-1β）大量產生時，將激活THUPS非經典分泌途徑，UPS貨物結合分子伴侶HSP90A發生去摺疊，結合ERGIC上的TMED10，誘導其發生寡聚化形成蛋白轉運體，在腔內分子伴侶HSP90B1的幫助下進入ERGIC這一膜泡載體。作者先前的研究發現ERGIC是自噬體的重要膜來源
【19】。鑑於分泌型自噬參與UPS，ERGIC可能是分泌性自噬的一個源頭細胞器。UPS貨物將通過ERGIC進入分泌性自噬的過程以及下游膜泡通路（包括：分泌性溶酶體和多泡體（MVB）等）,最終被運送到細胞外。當然也不排除ERGIC上產生的膜泡也可以通過其它途徑將UPS貨物分泌到細胞外（圖3）。
圖3. TMED10介導的蛋白質非經典分泌途徑工作模型
該研究提示類似於經典分泌途徑，非經典蛋白質分泌也存在一條（或者多條）蛋白質跨膜轉運通路調節蛋白的分泌。在細胞內THUPS可能是SEC61介導的經典分泌跨膜轉運的平行途徑，調節非經典蛋白質分泌。該研究還處於初期，很多問題還需要進一步解答，包括：該通路的分子細節、THUPS相關非經典蛋白質分泌組以及生理意義等。
據悉，這項研究由清華大學生命科學學院葛亮實驗室完成，實驗室張敏博士和博士生劉磊是文章的共同第一作者，葛亮研究員為通訊作者。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.031
參考文獻
1.S. O. Shan, P. Walter, Co-translational protein targeting by the signal recognition particle. FEBS Lett 579, 921-926 (2005).
2.G. Zanetti, K. B. Pahuja, S. Studer, S. Shim, R. Schekman, COPII and the regulation of protein sorting in mammals. Nat Cell Biol 14, 20-28 (2011).
3.T. A. Rapoport, L. Li, E. Park, Structural and Mechanistic Insights into Protein Translocation. Annu Rev Cell Dev Biol 33, 369-390 (2017).
4.W. Nickel, C. Rabouille, Mechanisms of regulated unconventional protein secretion.Nat Rev Mol Cell Biol 10, 148-155 (2009).
5.C. Rabouille, V. Malhotra, W. Nickel, Diversity in unconventional protein secretion. J Cell Sci 125, 5251-5255 (2012).
6.J. P. Steringer, W. Nickel, A direct gateway into the extracellular space: Unconventional secretion of FGF2 through self-sustained plasma membrane pores.Semin Cell Dev Biol 83, 3-7 (2018).
7.T. Schafer et al., Unconventional secretion of fibroblast growth factor 2 is mediated by direct translocation across the plasma membrane of mammalian cells. J Biol Chem279, 6244-6251 (2004).
8.V. Malhotra, Unconventional protein secretion: an evolving mechanism. EMBO J 32, 1660-1664 (2013).
9.J. M. Duran, C. Anjard, C. Stefan, W. F. Loomis, V. Malhotra, Unconventional secretion of Acb1 is mediated by autophagosomes. J Cell Biol 188, 527-536 (2010).
10.A. Rubartelli, F. Cozzolino, M. Talio, R. Sitia, A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. EMBO J 9, 1503-1510 (1990).
11.N. Kayagaki et al., Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature 526, 666-671 (2015).
12.J. Shi et al., Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature 526, 660-665 (2015).
13.C. L. Evavold et al., The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity 48, 35-44 e36 (2018).
14.G. Schatz, B. Dobberstein, Common principles of protein translocation across membranes. Science 271, 1519-1526 (1996).
15.P. A. Verhoef, M. Estacion, W. Schilling, G. R. Dubyak, P2X7 receptor-dependent blebbing and the activation of Rho-effector kinases, caspases, and IL-1 beta release. J Immunol 170, 5728-5738 (2003).
16.N. Dupont et al., Autophagy-based unconventional secretory pathway for extracellular delivery of IL-1beta. EMBO J 30, 4701-4711 (2011).
17.M. Zhang, S. J. Kenny, L. Ge, K. Xu, R. Schekman, Translocation of interleukin-1beta into a vesicle intermediate in autophagy-mediated secretion. Elife 4, (2015).
18.C. Semino, S. Carta, M. Gattorno, R. Sitia, A. Rubartelli, Progressive waves of IL-1beta release by primary human monocytes via sequential activation of vesicular and gasdermin D-mediated secretory pathways. Cell death & disease 9, 1088 (2018).
19.L. Ge, D. Melville, M. Zhang, R. Schekman, The ER-Golgi intermediate compartment is a key membrane source for the LC3 lipidation step of autophagosome biogenesis.Elife 2, e00947 (2013).
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