撰文 | 章臺柳
分化過程中，幹細胞和前體細胞通過一系列命運決定來完善其特性，直到達成功能性的最終狀態。譜系追蹤（lineage tracing）是推斷祖細胞和子代之間關係的金標準，即通常使用遺傳手段對錶達特定標記基因的祖細胞亞群進行標記，在後續時間點對其分化命運進行檢測【1】。近期發展的單細胞測序技術（single-cell RNA sequencing，scSeq）能夠捕獲處於分化各個階段的成熟細胞類型，可用於描述基因表達在空間上的"狀態圖譜（state map）"，為研究細胞狀態的層次結構及隨時間變化的基因表達動力學提供了工具【2】。
然而，無論是狀態圖譜還是譜系圖譜都無法完整且系統地重現分化過程。雖然scSeq能以高分辨率描述細胞狀態，但其無法將祖細胞的詳細狀態和其最終分化命運聯繫起來。而且，scSeq數據不能直接揭示祖細胞進入一個或多個命運的階段，或有多少不同途徑導致細胞達到相同的最終分化狀態。scSeq的高維特性導致同一數據可以有多種方法構建細胞分化軌跡。所以，需要尋找新的方法將細胞詳細的全基因組狀態和長期的動態行為聯繫起來。
近日，來自哈佛醫學院的Allon M. Klein在Science雜誌發表文章Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation，報道了同時描繪細胞狀態圖譜和細胞命運圖譜的新技術，即首先在細胞中表達"DNA條碼"，然後隨著時間的推移追蹤轉錄組變化。將新技術應用於造血系統中命運決定的研究，成功鑑定了啟動命運潛能的狀態，鑑定出兩條單核細胞分化路線。對姐妹細胞的分析顯示，細胞具有內在的分化命運偏好，這是單細胞RNA測序無法檢測到的。命運選擇發生的時間早於基於狀態圖譜的最新算法推演的時間，且細胞分化的過程與假時間軌跡具有精確且一致的動力學特徵。
研究人員同時檢測細胞轉錄狀態和細胞命運的策略是：利用遺傳手段對異質性祖細胞群進行DNA條形碼標記，部分細胞立即進行scSeq分析，部分細胞分裂分化後進行scSeq分析。DNA條形碼結構是在一個普遍表達的EF1α啟動子驅動的增強性綠色熒光蛋白基因的3'UTR區域插入一個隨機的28bp片段組成，構建了DNA條形碼庫LARRY（lineage and RNA recovery）。隨後利用改良後的慢病毒轉染將可遺傳的DNA條形碼插入到基因組中，scSeq測序可檢測到DNA條形碼。
該技術可檢測到3種克隆關係：1）在1次或2次分裂後可能捕獲最早時間點的姐妹細胞；2）在早期和後期觀察到的克隆，可將早期細胞的狀態與其姐妹細胞的分化命運進行比較；3）在後期的分化細胞，將揭示不同分化命運之間的克隆關係。
研究人員利用該技術對小鼠的造血幹細胞和祖細胞（HSPCs）的分化過程進行研究。體外研究首先分離出寡能（Lin-Sca-Kit+）和多能（Lin-Sca1+Kit+或LSK）祖細胞，並在支持多向分化的培養基中培養。條形碼標記後，細胞培養第2天便於慢病毒整合及細胞分裂。然後一半細胞用於scSeq分析"早期狀態early state"，一半細胞培養至第4天和第6天后取樣並進行scSeq分析。小鼠體內移植試驗的流程是：首先分離短期和長期造血幹細胞（Lin-ScahiKit+），DNA條形碼標記後培養2天，取出40%用於scSeq分析，剩餘的移植到10只亞致死劑量輻照的小鼠中，1周和2周後取樣用於scSeq。體外scSeq分析描繪出從多能祖細胞（multipotent progenitors，MPP）到9種成熟細胞的連續狀態圖，包括紅細胞（Er）、巨核細胞（Mk）、嗜鹼性粒細胞（Ba）、肥大細胞（Ma）、嗜酸性粒細胞（Eos）、中性粒細胞（Neu）、單核細胞（Mo）、漿細胞樣樹突狀細胞（pDC），Ccr7+遷移性樹突狀細胞（migDC）和淋巴前體細胞（Ly），細胞克隆展現出多樣化行為，如單系和多系分化、早期祖細胞的自我更新等。
移植實驗中，scSeq描述了從MPPs到Neu成熟的幾個階段、DCs、Mo、Er、B、T、Ba細胞的連續狀態圖，其中多種細胞內部具有異質性，如DCs細分為CD11+、CD8+、migDC、pDC等。 利用LARRY可以對單個細胞隨時間變化進行研究，發現單系克隆定位在命運潛能的區域；多系克隆定位在不同分化命運的祖細胞重疊的區域，即命運決定的邊界位置。具有不同分化命運潛能的前體細胞並沒有分成離散的細胞狀態，而是形成了一個具有結構的連續體。此外，雙重潛能區域的形成擴展了命運邊界，表明分化進程可以在某一段時間內獨立於命運決定而發生。將基因表達和細胞命運分化潛能進行綜合分析，體內和體外實驗的scSeq數據都顯示功能譜系分化的啟動在連續的造血祖細胞群體中是變化的，而且隨著基因的異質表達而共同表達，包括轉錄因子和其他功能性基因的變化，即細胞的譜系決定受到內在的譜系啟動和環境因素共同影響。利用機器學習對基因表達是否可以預測細胞命運進行研究，發現HSPCs中差異表達的基因對細胞命運的預測力較轉錄因子要高，而且轉錄狀態對細胞命運的最高預測率，體外為60%，體內為51%，即細胞自主轉錄狀態對細胞命運影響的最低限。
對數據的進一步分析發現，相比於早期狀態，4天或移植1周後的轉錄組對細胞命運的預測力更高，表明姐妹細胞間命運的高度一致性；體外培養或移植過程存在著影響細胞命運的可遺傳細胞生理特性，在scSeq中無法被檢測到。單核細胞分化具有兩條不同途徑：DC樣和Neu樣單核前體細胞分化而來，分別對應著近期鑑定的MDPs（Mo-dendritic progenitors）和GMPs（granulocyte- Mo progenitors）。經過分析驗證了假時間分析用於捕獲分化進程的準確性，而基於scSeq數據的數學模型不能全面地預測細胞的命運選擇。
總的來說，研究開發了一種同時獲得細胞轉錄狀態圖譜和譜系圖譜的新技術，並展示了其在譜系追蹤研究中強大的應用潛能，為研究細胞命運決定提供了新工具。
原文鏈接：
https://science.sciencemag.org/content/367/6479/eaaw3381
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參考文獻
1. P. Jensen, S. M.Dymecki, Essentials of recombinase-based genetic fate mapping in mice.MethodsMol. Biol. 1092, 437–454 (2014).
2. C. A. Herring,B. Chen, E. T. McKinley, K. S. Lau, Single-cell computational strategies forlineage reconstruction in tissue systems. Cell. Mol. Gastroenterol. Hepatol. 5,539–548 (2018).
