医工荟萃，不是萝卜开会，融合创新才是硬道理！
上一讲咱们说完了免疫组化的所有内容，这一讲开始咱们来说说几种常见的ELISA的做法。
ELISA干啥用
我们在第七讲中介绍Western的时候，解释了Western的原理，也就是关于蛋白、一抗和二抗三个小盆友的故事。ELISA的原理本质上与Western一样，只是随着检测的目的蛋白不同，原理略有调整，而已。Western的基本原理是将待测蛋白结合到一张膜上，然后依次用一抗识别蛋白，再用二抗识别一抗，最后显色。Western操作时对样本的处理使得Western检测的样本基本都是抗原而不是抗体，小伙伴们仔细想想，是不是也没听说过用Western来检测哪种抗体的表达？ELISA在这一点上则有更多优势。ELISA是将未处理（不煮、不固定）的样本结合在塑料96孔板底（酶标板，这里请参见小贴士1），再利用上述“手拉手”原理进行检测，在保持蛋白原有空间结构这一点上，ELISA比免疫组化还要更胜一筹，
但是ELISA却是没有办法在组织“原位”做的，所以每种方法都各有千秋。不过呢，正是由于ELISA可以人为地将不经处理的蛋白结合在载体上，这就赋予了ELISA一个得天独厚的优势，那就是ELISA不仅可以用来检测抗原，还能用来检测抗体，所以ELISA也因此成为如今应用最为广泛的检测抗体的方法。再加上ELISA检测的是液体样本，为体液、培养上清的检测提供了便利。另外，ELISA还具有非常高的灵敏度，检测蛋白的量级在皮克级（不过现在高灵敏的ECL发光液也让Western检测的灵敏度达到了皮克级）。ELISA的分类及原理
ELISA的种类有很多，我们经常用到的有两种：夹心法和间接法。其中的夹心法又可以分为两种：一种是双抗体夹心法，检测对象是抗原；另一种是双抗原夹心法，检测对象是抗体 。而间接法检测的对象也是抗体。我们实验中最常使用的是双抗体夹心法测抗原和间接法测抗体，市面上的试剂盒大多也是这两种。但是本侠还是把三种ELISA（两种夹心法和一种间接法）的原理都简单说一说，大家就当丰富人生阅历吧，哈哈哈。
- 双抗体夹心法检测抗原：先把可与带检测抗原结合的抗体（可以理解为一抗）结合到酶标板上，这个过程叫做“包被”。然后加入含有带检测抗原的样本，这个时候样本里的抗原会跟事先结合在酶标板上的抗体结合，然后再加入另一种也能与该抗原结合的抗体（可以理解为二抗，这里请参见小贴士2），但是这个抗体带有酶标记（一般也是HRP，关于HRP大家可以看看之前对Western的介绍），接着不用本侠点破聪明的小伙伴们也会猜到，就是加入HRP的底物进行显色反应，但是本侠相信就算你再聪明你恐怕也不一定能想到，这后面还有一个操作，就是显色以后在合适的时间点需要终止反应（这里请参见小贴士3），这个操作在Western和免疫组化里是不涉及的，并且等后面的章节本侠说完流式细胞术你会发现，流式也不需要终止反应，因为流失抗体是荧光标记，连酶都不用，哈哈哈哈。
- 双抗原夹心法检测抗体：与双抗体夹心法非常相似，不同之处就是将抗原和抗体的位置颠倒，也就是最先结合到酶标板上的是抗原，然后用这个抗原去抓样本中的抗体，接着再用含有标记的抗原与被抓到的抗体结合，接下来同样是显色过程。这种方法本侠没有操作过，不敢过多言论。
- 间接法测抗体：与上两种夹心法不同。间接法是将抗原结合到酶标板上，然后加入含有待检测抗体的样本，此时样本里的抗体会跟酶标板上的抗原结合，接着再用带有酶标记的抗体与样本中被结合在抗原上的抗体结合，后面是同样的显色、终止和检测步骤。这种方法过程上跟Werstern和免疫组化几乎一样，但是本质上这种ELISA检测的是抗体，而不是结合在载体上的抗原，所以性质上跟Werstern和免疫组化还是不同的。
猪猪侠小贴士
1. 做ELISA用的96孔板专业术语叫做酶标板（ELISA PLATE），外形与无菌96孔平底细胞培养板一毛一样，带盖，实则内部结构别有一番设计。酶标板每个孔的孔底经过处理而变得对蛋白质具有高亲和力，这样才能在做ELISA的时候牢牢抓住抗原或者抗体。96孔平底培养板的板底当然也是经过处理的，但它的目的是为了改变对细胞的粘附力。酶标板和96孔平底培养板还有一个本质的区别就是透光性。酶标板在做完ELISA中的各个孵育步骤以后，要放在酶标仪里面，用来检测反应过后每个孔中样本的吸光度，这就要求酶标板透光性又好又均匀，而96孔平底培养板却没有这个要求。
2. 我们在Western和免疫组化里经常提到一抗和二抗，但是这里双抗体夹心法里的一抗二抗，其实跟之前提到的一抗和二抗有本质区别，主要是二抗的不同。之前提到的二抗结合的是一抗，所以是一个抗抗体，而双抗体夹心法里的二抗，本质上还是个一抗，因为它结合的还是抗原，不是抗体，只不过它跟其它二抗一样，也带HRP标记，所以姑且也叫它二抗吧。
3. 关于为什么ELISA要终止反应，而同样是用HRP标记的抗体来检测抗原的Western和免疫组化却不用终止反应，本侠的想法是，可能与显色的形式和结果的判定方案有关的。ELISA实验完成后，酶标板里的液体样本会因为被检测抗原/抗体的量不同而呈现不同深浅的颜色，然后用酶标仪来读取这些带有颜色液体的吸光值，按照吸光值的大小来反映被检抗原/抗体的多少。由于是通过颜色的深浅来间接量化抗原/抗体的量，因此实验过程中应该尽量减少干扰颜色变化的因素，而反应时间长短则是其中之一。也就是说，如果在加了HRP的底物以后任由反应无限进行，最终所有检测孔里的液体的颜色可能会变得一样深。免疫组化反应以后也会在切片上出现颜色，但是免疫组化看的是切片上出现的颜色多少，而不是深浅，所以免疫组化不用顾及反应时间对颜色深浅的影响。至于Western，本侠真的不敢妄下论断，纯属瞎猜地跟小伙伴们聊一聊。Western现在的显色方案是利用酶和底物化学反应后生成的能够产生荧光的产物，然后用成像系统检测荧光，那么Western不用终止反应的关键可能就在荧光上了，本侠个人无根据地言论想说的是，是不是荧光可表征的动态范围比颜色深浅能表征的动态范围要广，所以Western可以任由反应进行而不用担心荧光测不出差异，但是颜色就不行，颜色很容易变得看不出来深浅的差异。（写这么长一段，也不知道看不看的明白，看不明白会不会被打，嘻嘻嘻）
下一讲我们将跟大家说说双抗体夹心法测抗原和间接法测抗体的具体操作。
搜索关注微信公众号“医工荟”，查阅更多精彩内容！
