引言

上期提到科學家們給病毒“拍照”用的不是光學顯微鏡，主要是電子顯微鏡。比如這次的新冠病毒COVID-19發佈的幾張圖片。

電子顯微技（後文稱電鏡）的原理可以概括為：電子槍發射的電子束被加速後，經電磁透鏡匯聚，打到樣品上。

一部分電子被“反彈”，一部分電子穿透樣品，這兩種電子攜帶了樣品的信息。我們用探測器採集、放大並分析這些信號就能實現對病毒的拍照。

相比光學顯微鏡，電子顯微鏡所使用的“光源”（實際是電子源）波長更短，根據阿貝方程，分辨率更高。具體可見

但是，正如女士出門曝光前都得化化妝，病毒送進電鏡前也得可勁兒捯飭，不是提取完就能拍攝的。本文將類比化妝，一步步分析病毒拍照前有哪些步驟。

固定和脫水

化妝前講究先補水，皮膚乾乾巴巴很難受，但是，給病毒化妝正相反，要基本保證生物樣品的完全乾燥，不含有任何揮發性物質。

原因是：作為“照明光”的電子束流要在接近真空的環境中才能被準確操縱。否則，“光路”上的氣體分子會散射電子，使得電子束聚焦能力下降，最終導致分辨率降低。

被散射的電子束

另外，如果含有氧化性氣體，電子槍中用於產生電子的材料（比如金屬鎢）在高溫下（2000度以上）很容易被氧化，燈絲報廢。運氣不好的話，幾十、上百kV的高壓電直接把艙室擊穿，很容易造成危險。

2700K等數據是電子槍工作時燈絲的溫度

所以，在拍攝中，整個電鏡艙室都要保持真空，包括樣品所在的環境。

另外，如果病毒樣品中含有水、乙醇等揮發性物質，在真空條件下會沸騰，沒錯，沸騰，直接變氣態。具體原理可見 ，水的體積瞬間變大可能會破壞病毒結構，導致難以分辨。

0.0075°C的水在611.73Pa下沸騰

因此，給病毒化妝中第一步就是除去水分子。

但是，液體的表面張力是維持生物樣品完整外形的重要原因，換句話說，水分子除去後，樣品可能會因為環境的改變而坍縮，同樣不利於觀測。

不脫水不是，脫水也不是，這下麻煩了。

如果突然把水抽走，固體表面會因為內應力而被破壞

就像先拍照再修圖一樣，現在的做法是，在脫水前把病毒和周圍組織的模樣都固定下來。維持冠狀病毒結構的物質主要由蛋白質外殼＋脂質包膜組成，所以分別選用戊二醛＋四氧化鋨進行固定。

這個過程可以類比交聯，就像拿膠把一捆捆繩子粘起來，粘後的繩子結構更穩定，原理可見

化妝要處處講究輕柔，除了使用固定劑，為了減小脫水時對樣品結構的破壞，實驗室裡經常會用乙醇逐級脫水或者丙酮脫水的手段，先把樣品中的水置換為揮發性強的溶劑。

之後，再用

總之，這種方法能最大限度地保持樣品原來的形態，比如新冠病毒。固定＋溶劑置換＋超臨界乾燥已經成了現在生物電鏡制樣的規範流程。

正如不同膚質膚色的人化妝策略不一樣，對於這兩種不同的電鏡，後續病毒樣品的處理有著各異的思路。

撲粉

化妝時，想讓皮膚顯白要撲粉，這樣才能讓皮膚反射更多的光子，擁有一副光彩照人的模樣。不僅人愛美，病毒拍電鏡照片前也得“撲粉”。

掃描電鏡依靠二次電子和背散射電子，想看到清晰明亮的圖像，就得讓電子被樣品“彈回去”。

想讓二次電子多，樣品就得有足夠數量的核外電子，不然電子束流打進樣品，樣品自身電子也沒法獲得能量躍出表面。

想讓背散射電子多，樣品原子核就得大，如果原子核小，樣品中過於空曠，電子束很容易穿透樣品。

另外，如果樣品不導電，比如病毒類生物製劑，電子槍打過來的電子就會在樣品表面積累電荷，這些電荷會影響後續電子束流的運動，最終讓圖像失真。

所以，需要在生物樣品上蓋一層導電的材料，最好還是惰性強的重金屬元素。

重金屬元素核外電子多，原子核大，能產生更多的二次電子和背散射電子，有利於獲得更好的圖像。現在實驗室裡一般會採用鍍金和鍍碳的手法。

對於掃描電鏡，完成鍍膜後的病毒樣品就完成所有化妝的步驟，終於可以曝光了。

不過對於透射電鏡，鍍膜這種行為就是負擔。

透射電鏡利用的是“穿透”樣品的電子，透射電子越多，信號越強，越有利於成像。

如果鍍膜，電子都給散射沒了，透不過去。類似上課得化淡妝，參加大型活動化得濃，針對透射電鏡，病毒也另一套化妝方案。

樹脂包埋

既然要電子能透過去，就不能讓樣品太厚。所以最關鍵的一點就是讓樣品變薄。

切片方式

透射電鏡的樣品一般需要100nm以下，大約500片這樣的樣品疊起來才有一根頭髮絲的直徑大小。做過菜的都知道，給肉塊切片它們老是亂動，很容易切歪，沿著頭髮絲直徑切不太像人能幹的活。

另外，<strong>脫了水的樣品就像一塊中空結構的薯片，很脆弱，在強大的電子束流下，這麼薄的樣品很容易被打到變形（事實上，經常出現做透射電鏡表徵把樣品打出個洞的情形）。

為了解決這兩個問題，科學家們想到先用樹脂把病毒樣品包封起來，就像拿熱的豬皮凍（液體）滲入薯片後，再冷卻到室溫，豬皮凍會變成固體，相當於給薯片一個結構的支撐。

右上角是大塊的樹脂

類似地，液態樹脂是一些聚合物單體，屬於小分子，很容易滲入病毒和周圍組織。浸泡一段時間後，加熱將樹脂單體交聯成大分子聚合物，之後用特殊的切片方式就能把樣品切到100nm以下。

三角形的那個就是刀片

給病毒塗口紅

生活經驗告訴我們（作者剛查的），化妝的最後一步是塗口紅。我猜測主要目的是增強<strong>對比度

類似地，想讓病毒被看得更清晰，可以把病毒染得更黑。考慮到透射電鏡圖片下的黑主要是因為電子透不過去，所以可以選用重金屬元素和病毒結合。

實驗室中常用醋酸鈾和檸檬酸鉛，這兩種化學物質可以和病毒樣品中的蛋白、磷脂以及核酸反應並結合，電子束打過來的時候病毒就變得更“黑”，能有效幫助觀察。這種方法叫做正染色技術。

如果不染色，更不清楚，甚至難以分辨右圖的輪廓，這張圖也有可能是操作有問題的負染

除了有正染，也有負染。負染不需要前述的固定和樹脂包埋等步驟，只需要提取病毒然後染色，再幹燥樣品製片就行。對於病毒樣品，負染技術使用得更頻繁，這麼一看，病毒似乎不怎麼需要化妝，天生麗質。

有意思的是，一開始幾張公佈出來的新型冠狀病毒透射電鏡照片似乎用的是正染（比如上圖），不過也有可能是負染，因為上圖同時具有正染（病毒黑，背景白）和負染（病毒周圍黑，病毒白）的特點。可能是急著出圖，妝化急了。

當然，最近公佈的新冠病毒負染照片看起來就專業多了。

負染環境黑

請留步

需要說明一點，<strong>在固定脫水那一步，病毒已經“死亡”，如果我們想動態地看病毒如何入侵正常細胞，還是需要光學顯微鏡。

但是，上期說普通光學顯微鏡分辨率達不到 ，下篇文章專門介紹幾種超分辨率顯微技術，2014年諾貝爾化學獎給的就是幾位這個領域的祖師爺，感興趣的朋友可以點個關注。

STORM技術拍攝到的細胞裡的actin，邊界是細胞膜

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