最近，他們課題組又有了新的成果。2020年3月5日，清華大學藥學院肖百龍課題組與生命學院李雪明課題組在神經科學領域權威學術期刊
《神經元》（Neuron）在線刊登了題為《機械門控Piezo離子通道的“門塞和閂鎖”門控機制》的研究論文，揭示了Piezo通道利用類似門塞和閂鎖的作用原理對其胞內側離子通透路徑進行門控的精巧分子機制，並鑑定發現一種因缺失“門塞”結構元件而獲得機械超敏性的新型Piezo1剪切變體亞型。該研究成果不僅有力促進了我們對Piezo通道如何將機械力刺激轉化為電化學信號這一核心問題的理解，也將有助於對其功能性質的針對性改造與干預，為最終實現基於Piezo通道的生物技術開發，藥物發現以及疾病治療奠定基礎。
機械門控Piezo離子通道是一類能夠快速響應機械力刺激並介導陽離子流入細胞、進而誘發細胞興奮和信號轉導的一類重要離子通道，在哺乳動物細胞中包含Piezo1和Piezo2兩個成員 (Coste et al., Science 2010; Coste, Xiao et al., Nature 2012)。Piezo1被發現在多種細胞組織中作為機械力分子受體參與調控血管及淋巴管發育、血壓穩態維持、骨的生成與重塑等諸多功能；而Piezo2則介導哺乳動物的觸覺、本體覺（譬如體位平衡感知）以及內臟覺（譬如肺的收縮擴張以及血壓感知和心率調節）的機械感知。Piezo基因的遺傳突變被發現引起多種人類遺傳疾病，包括紅細胞乾癟綜合症、淋巴管水腫、遠端關節攣縮症、觸覺缺失症等。Piezo2通道功能缺失導致人體對病理機械超敏痛感知的喪失，確證其可以作為開發新型鎮痛藥物的重要靶點。
肖百龍博士課題組近年來綜合利用生化結構、電生理膜片鉗、高通量藥物篩選、轉基因小鼠模型以及人類遺傳學等多學科研究手段，聚焦解答機械門控Piezo通道如何將機械力刺激轉化為電化學信號，以及其如何利用自身機械敏感性和通道特性來決定相關的生理病理功能這兩方面的關鍵科學問題，並致力於開發以Piezo通道為靶點的新型藥物及技術。迄今在Piezo通道的三維結構解析(Nature 2015, 2018，2019)、分子機制揭示 (Neuron 2016；Nature Communications 2017)、小分子藥物發現(Nature Communications 2018)、以及生理病理功能探索(Cell Reports 2019；eLife 2019)等方面取得了系列重要研究成果。肖百龍博士獲邀為Annual Review of Pharmacology and Toxicology (2020 Jan 6;60:195-218) 撰寫了2020年度綜述文章，系統介紹了Piezo通道在近10年所取得的重要研究進展以及其作為新型藥物靶點進行藥物開發的重要前景和策略。
肖百龍課題組與李雪明課題組合作於2018年與2019年在《自然》期刊相繼報導了鼠源全長Piezo1與Piezo2的三葉螺旋漿狀結構及工作機制，揭示了其以三聚體共計114次跨膜螺旋區的方式組裝成含跨膜螺旋區最多的大型膜蛋白複合體，發現了決定其機械敏感性以及離子選擇性的獨特結構基礎，為分析其響應機械力刺激而導致通道開放的熱力學過程提供了準確參數，並創新性提出其行使機械門控的槓桿作用機制假說以及雙門控作用機制假說。他們認為Piezo通道的離子通透路徑上存在兩處開關閘門，其中位於跨膜區的開關閘門通過位於孔道正上方的胞外的帽子區的旋轉運動來控制，而位於胞質區的開關閘門則可能通過槳葉和胞內側長杆結構以類似槓桿作用原理來控制（圖A）。然而Piezo通道的胞質側的確切離子通透路徑、開關閘門位點、以及門控機制都不清楚。
在最新的這篇《神經元》論文中，研究人員綜合利用基於結構分析的定點突變、膜片鉗電生理功能研究、新型剪切變體的鑑定發現等多種研究手段，確定了Piezo通道胞內側的三個側向離子通透路徑(lateral portal)、以物理方式堵塞側向離子通透路徑的側向門塞結構元件(lateral plug gate)、以及對側向門塞進行控制的“閂鎖”元件(latch) （圖A）。結合對這些關鍵元件的功能研究，他們獲得了系列實驗數據來幫助其首次提出Piezo通道利用這些關鍵功能元件以類似“塞子和閂鎖”的物理方式來調控側向離子通透路徑的關閉與開放的精巧分子作用機制。
首先，結構分析提示Piezo通道的胞內側可能存在垂直方向或側向這兩種可能的離子通透路徑 （圖A）。研究人員通過對側向離子通透路徑上的9個氨基酸位點進行定點突變，成功將陽離子選擇性的Piezo1通道造成了一個陰離子選擇性的通道。而對垂直方向的氨基酸進行突變並不引起離子選擇性的改變。這些研究結果佐證了Piezo1通道利用其胞內側的三個側向通透路徑(lateral portal)來通透陽離子。
其次，他們通過結構分析發現三個側向路徑的胞內開口處被一段氨基酸序列以物理形式堵塞（圖A）。電生理功能研究發現如果把這一段氨基酸去除，單通道電導和機械敏感性都會顯著增加，鈣離子通透性也發生改變。基於這些結構功能分析結果，他們提出了這一段氨基酸序列形成側向門塞結構(lateral plug gate)來調控側向離子通透路徑的開放與關閉。
非常有趣的是，研究人員鑑定發現了一種在多種細胞組織都有表達的全新的Piezo1剪切變體，其所缺失的一段序列正好包含了側向門塞結構序列，他們把這一剪切變體命名為Piezo1.1（圖B）。電生理功能研究發現Piezo1.1剪切變體的通道性質與缺失側向門塞結構序列的突變體一樣，具有更大的單通道電導和更為靈敏的機械敏感性。Piezo1.1是目前已鑑定發現到的對機械力最為敏感的Piezo通道家族成員。非常驚奇的是他們進一步發現之前所報導的Piezo2的一個剪切變體也正好缺失側向門塞結構這一保守序列,提示Piezo1和Piezo2兩個基因都利用選擇性剪切的方式來調控側向門塞這一關鍵結構域來調控其通道性質。
為了證明Piezo1.1剪切變體功能的改變確實是因為在結構上缺失了側向門塞結構所引起，他們解析了Piezo1.1剪切變體的冷凍電鏡三維結構。與他們的假設相吻合，Piezo1.1剪切變體缺失了側向門塞結構，導致側向離子通透路徑的開口處處於完全開放狀態。
研究人員進一步探索了三個側向門塞如何協同調控三條側向離子通透路徑。結構分析發現，三個側向門塞結構被位於其前後兩段的結構序列錨定到Piezo1通道胞內側正中軸上，形成類似閂鎖結構(latch)來協同控制三個門塞結構（圖A）。單通道記錄發現破壞Piezo1這一組裝方式的突變體會產生亞電導（sub-conductance）開放，而且非常有意思的是亞電導的大小恰好是全電導的三分之一，提示三條通透路徑以量子化而非協同的方式開放（圖C, D）。
以上研究揭示了Piezo通道這類生物機械傳感器的精細結構組裝方式及精巧的機械門控機制，以及自然進化對這一結構和機制的精妙調控。
機械門控Piezo離子通道的“門塞和閂鎖”門控機制示意圖
（A）Piezo通道關鍵結構元件示意圖。
（B）Piezo開放時跨膜區閘門(TM gate)可以被位於其正上方的Cap結構元件的旋轉運動所打開，側向門塞元件則可能被Blade-Beam結構元件所傳遞的機械力以類似拔門塞的方式部分打開，導致側向離子通透路徑的陽離子流通。
（C-E）側向塞子被移除（C）或者由於突變造成閘門不協調（D，E）的情況下，側向門塞的門控模式的改變導致通道特性的改變。
圖中紅虛線和紅實線分別代表關閉和開放狀態的離子通透路徑。
清華大學藥學院肖百龍博士和生命學院李雪明博士為本論文共同通訊作者。清華大學藥學院博士後耿潔（現就職於北京中醫藥大學），生命學院2016級博士生劉文豪， 2015級博士生周珩，肖百龍課題組張廷鑫博士（現美國MD安德森癌症中心博士後），藥學院博士後王莉為並列第一作者。另外，肖百龍課題組的張明敏博士（現美國密歇根大學博士後），博士生李禕然，李雪明課題組的沈鉑也參與了部分工作。
本研究得到了國家自然科學基金委傑出青年科學基金、重點項目、以及科技部重大研發計劃（31825014, 2016YFA0500402, 31630090, 2015CB910102, 31570730, 2016YFA0501102, 2016YFA0501902, 2016M601003）、國家萬人計劃暨科技創新領軍人才項目、清華－北大生命科學聯合中心、北京結構生物學高精尖創新中心、生物膜國家重點實驗室的資助。同時得到了清華大學冷凍電鏡平臺、清華大學高性能計算平臺和國家蛋白質設施實驗技術中心(北京)的支持。
肖百龍
清華-IDG/麥戈文腦科學研究院研究員
清華大學藥學院研究員
清華-北大生命聯合中心研究員
原文鏈接:
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2020.02.010
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