Gut: 腸道微生物特徵的發現推動了肥胖患者益生元干預的功效

導讀

腸道菌群已被提出作為代謝紊亂的有治療靶標。菊粉作為益生元可減輕肥胖症和相關疾病。本研究的目的是研究干預前腸道菌群的特徵是否決定了對菊粉的生理反應。在飲食干預前，從4個肥胖供體的糞便中採集不同微生物多樣性和組成的糞便，並接種到經過抗生素預處理的小鼠(hum-ob小鼠;人性化肥胖老鼠)。喂hum-ob小鼠高脂飲食並用菊粉治療。3個月後比較在hum-ob小鼠中菊粉治療後與一組補充菊粉的肥胖個體的代謝和微生物變化。

結果發現，從不同肥胖個體中獲得糞便菌群的hum-ob小鼠對高脂肪飲食中菊粉的補充有不同的反應。在hum-ob小鼠中觀察到幾個細菌屬，Barnesiella, Bilophila, Butyricimonas,Victivallis,Clostridium XIVa, Akkermansia, Raoultella 和 Blautia與代謝結果（肥胖和肝脂肪變性減少）相關。另外，在肥胖個體中，厭氧菌，Akkermansia和Butyricicoccus的干預前水平促進對菊粉的應答導致體重指數下降。這些發現支持在使用益生元進行營養干預之前表徵腸道菌群對於增加肥胖和代謝紊亂的積極結果非常重要。

論文ID

譯名：腸道微生物特徵的發現推動了肥胖患者益生元干預的功效

期刊：Gut

IF：17.943

發表時間：2020.1.17

通訊作者：Nathalie M Delzenne

作者單位：比利時布魯塞爾盧凡大學盧凡藥物研究所代謝和營養研究組

實驗設計

在飲食干預前，從4個肥胖供體的糞便中採集不同微生物多樣性和組成的糞便，並接種到經過抗生素預處理的小鼠(hum-ob小鼠;人性化肥胖老鼠)。喂hum-ob小鼠高脂飲食並用菊粉治療。3個月後比較在hum-ob小鼠中菊粉治療後與一組補充菊粉的肥胖個體的代謝產物和微生物變化。

結果

1. FMT後小鼠微生物群的特徵

首先從菊粉干預之前的肥胖患者隊列中選擇四個捐獻者，它們的區別在於腸道微生物群組成不同，以便對抗生素-PEG預處理的小鼠進行FMT（圖1A）。通過總細菌的急劇減少證實抗生素PEG的效率，其可以消除超過99.8％的糞便細菌（圖1B，C）。除SPF對照組外，所有小鼠均通過FMT與肥胖患者的糞便重新定殖。供體為肥胖、藥物依賴型糖尿病或非糖尿病患者，糞便細菌屬水平豐富度不同(Chao1指數，圖1D)，腸道菌群組成科水平也不同(圖1E)。未加權的UniFrac距離證實SPF和hum-ob小鼠之間的分佈不同（圖1F），hum-ob小鼠的腸道菌群與各自的供體非常接近。此外，在人類中比例最高但在小鼠中極少存在的柔嫩梭菌群水平在所有hum-ob小鼠中均明顯增加，證實人類細菌在受體小鼠中定殖（圖1G）。

圖1.從肥胖供體到抗生素預處理小鼠的FMT。

（A）實驗設計。（B和C）在不同時間點，通過qPCR分析抗生素治療小鼠的糞便中的總糞便細菌。（D）在整個隊列中，使用chao-1指數估算α多樣性。（E）相對於科水平的豐富度，每個捐贈者所佔比例超過1％。（F）β多樣性指數Unweighted UniFrac的主座標分析。（G）在FMT後4周，通過qPCR定量從CC中提取的柔嫩梭菌DNA。

2. 菊粉對hum-ob小鼠體重和肥胖的影響。

與SPF小鼠相比，接種供體1 （D1）糞便的小鼠體重顯著增加，且僅在這一組通過添加菊粉恢復體重（圖2A）。在肥胖方面，FMT增加D1組hum-ob小鼠的SAT和附睪脂肪組織（圖2B,C），而在D1組和D4組補充菊糖減少肥胖。各組內臟脂肪組織重量均相似（圖2D）。在SAT中，D1小鼠的平均脂肪細胞面積增加，而菊粉完全阻止這種作用（圖2E，F）。菊粉治療可顯著降低D1和D4 hum-ob小鼠cd11c的表達，表明菊粉可降低SAT中活化的巨噬細胞浸潤（圖2G）。與未經治療的對應者相比，菊粉還降低D1受體的SAT中炎性標誌物（tnfa和ccl2）的表達（圖2G）。在D1 hum-ob小鼠中，菊粉降低脂肪酸（FA）受體cd36的mRNA水平。在D1和D4 hum-ob小鼠中，菊粉都降低調節脂肪細胞分化和脂肪生成的Pparg mRNA水平。在BAT中，菊粉可特異性增強D1小鼠中產熱標誌物（ucp1，prdm16和ppargc1a）的表達，這種現象可促進FA氧化（圖2H）。

圖2.菊粉對humob小鼠體重增加和肥胖的差異反應。。

（A）補充或不補充菊粉的SPF和人源化小鼠的體重增加。（B–D）皮下，附睪和內臟脂肪組織的重量。（E）代表H＆E染色的SAT圖片。（F）SAT中的脂肪細胞平均面積（µm）。（G和H）通過qPCR在SAT和BAT中測量的基因表達。

3. 菊粉可降低D1和D4 hum-ob小鼠肝臟脂質積累。

菊粉僅在D1和D4中降低脂質(甘油三酸酯和膽固醇)的積累（圖3A-D）。D1小鼠的絲氨酸79殘基上的乙酰輔酶A羧化酶（ACC）磷酸化增強，菊粉和AMP蛋白激酶（AMPK）的激活進一步增強這種作用（圖3E）。菊粉還降低D1和D4小鼠的核固醇調節元件結合蛋白1 c和2（Srebp-1c和Srebp-2）（圖3F，G）。在D1小鼠中，菊粉降低cd36和ppargc1a mRNA，兩種涉及FA攝取和氧化的蛋白質（圖3H）以及控制甘油三酸酯合成的標誌物的mRNA水平，例如acaca，scd1，dgat2和elovl3（圖3H）。菊粉還降低D4小鼠中的scd1和dgat2 mRNA。這些數據表明，菊粉通過調節參與脂肪形成和FA氧化的基因的表達降低D1和D4小鼠的肝脂質含量。

圖3.菊粉可降低D1和D4 humm-ob小鼠肝臟脂質積累。

（A）肝臟切片中性脂質的組織化學檢測。（B–D）肝臟的總脂質，甘油三酸酯和膽固醇含量。（E–G）pACC的免疫印跡和定量，以及Srebp-1c或Srebp2的核表達。（H）qPCR檢測肝臟基因表達。

4.菊粉改善D1 hum-ob小鼠的肌肉胰島素敏感性。

腓腸肌的生化分析顯示，D1的hum-ob小鼠肌內脂質和甘油三酯的含量僅高於SPF對照小鼠，而SPF對照小鼠的肌內脂質和甘油三酯的含量被菊粉去除（圖4A,B）。與這些發現一致，菊糖顯著增強D1 hum-ob小鼠的蛋白激酶B、Akt（絲氨酸473）和哺乳動物雷帕黴素靶蛋白mTOR（絲氨酸2448）磷酸化水平（圖4C，D）。如在肝臟中一樣，菊粉降低D1小鼠比目魚肌中cd36 mRNA的表達。在D1和D4 hum-ob小鼠中，Pparg mRNA在D1肌肉中表達增加，而在菊粉中降低（圖4E）。僅在D1小鼠中，菊粉抵消了hum-ob小鼠中Cpt1b mRNA的增加（圖4E）。這些數據支持菊粉通過減少FA攝取提高D1小鼠肌肉中的胰島素敏感性，從而限制PPARg（過氧化物酶體增殖物激活的受體γ）配體的可用性。

圖4.菊粉改善D1 hum-ob小鼠的肌肉胰島素敏感性。

（A和B）腓腸肌中總脂質和甘油三酸酯含量。（C和D）免疫印跡和定量pAkt與總Akt蛋白的比例和p-mTOR與α-tubulin的比例。（E）通過qPCR測量比目魚肌中的基因表達。

5. 菊粉不會改變整體菌群組成，但會引起供體體內菌群組成特異性變化。

在所有的組中，菊粉都增加了盲腸的含量和組織的重量，表明菊粉發酵過程相似（圖5A，B）。與對照小鼠相比，FMT降低所有hum-ob小鼠的微生物α多樣性（Chao1和Shannon指數）（圖5C，D）。在D2和D4小鼠中，隨著菊粉的加入，均勻度進一步下降。未加權的UniFrac距離顯示出供體之間的個人差異導致的聚類（圖5F）。單因素分析顯示，菊粉在hum-ob小鼠的門和科水平上誘導供體特異性變化（圖5E）。鑑定18個屬的子集，這些子集受到菊粉的不同調節，具體取決於供體。顯著的代謝作用與菊粉調節的18個屬之間的相關性分析顯示，在鑑定出的幾種相關性中，一些屬與肝脂質蓄積呈正相關（Barnesiella，Butyricimonas，Bilophila，Hungatella和Victivallis）。並且在D1小鼠中顯著降低，該組表現出更好的菊粉代謝反應。此外，在第二種菊粉-應答者組D4小鼠中，與肝脂質含量呈負相關的四個屬（Clostridium XIVa，Raoultella，Blautia和Akkermansia）特別增加。

圖5.菊粉不會改變整體菌群組成，但會引起供體體內菌群組成特異性變化。

（A和B）盲腸含量和組織重量。（C和D）α多樣性指數的測量：chao-1和Shannon。（E）每一組的科水平相對豐富度佔1%以上的條形圖。（F）β多樣性指數未加權UniFrac的主座標分析。（G）菊粉處理顯著改變屬間的Spearman相關性與菊粉處理最顯著的代謝變化之間的Heatmap。

6. 微生物群相關的標準驅動hum-ob小鼠和人類對菊粉治療的代謝反應。

小鼠的FMT模型無法識別可能與體重變化有關的細菌。為此，我們使用菊粉治療的肥胖患者的整個人類隊列，驗證某些細菌是否可能與菊粉對BMI的調節有關。在干預結束時，根據BMI變化的中位數將參與者分為菊粉組（n = 51），分別為無反應者（BMI不變）和反應者（BMI降低；圖6A）。Chao1指數反映腸道菌群的豐富程度，無反應組和反應組相似（圖6B）。令人驚訝的是，在臨床干預期間，使用所有細菌屬的變異的PCA不允許區分無反應者和反應者（圖6C）。有趣的是，PCA只考慮hum-ob小鼠中突出顯示的菊粉屬的變異，傾向於將無應答者和應答者組分開（圖6D）。PLS-DA基於人類實驗方案中相同屬子集（在小鼠中鑑定）的變異，表明負責不同BMI反應的主要變異似乎是應答者中Bifidobacterium spp的增加同時伴隨Collinsella, Barnesiella, Akkermansia和Bilophila的降低（圖6E）。單因素分析證實，與無應答者相比，有應答者的Collinsella和Akkermansia明顯減少（圖6F）。為了評估某些屬是否可以預測對菊粉的反應，基於干預前存在的所有屬進行PLS-DA分析（圖6G）。在無應答和應答者之間觀察到清晰的分離；在負責該特定聚類的主要變量中，發現了上面概述的一些屬，例如Collinsella，Bifidobacterium，Akkermansia，Bacteroides和其他新屬，例如Butyricicoccus似乎在應答者中高度存在（圖6G）。與無應答者相比，單因素分析僅顯示應答者中Akkermansia和Butyricicoccus的基礎含量顯著較高，而厭氧菌的水平較低。這些數據表明，就對菊粉的特異性反應而言，一部分細菌可能在人類隊列中觀察到的BMI個體間反應中發揮重要作用。

圖6.在多中心人類隊列中對菊粉的干預研究顯示，菊粉有應答者（R）和無應答者（NR）體重指數（BMI）改善和腸道菌群變化。

（A）菊粉組干預3個月後，BMI的變化。（B）NR（n = 23）和R（n = 24）中的Chao1指數（α多樣性）。（C–D）基於NR和R患者的所有屬（C）或選定屬（D）的腸道菌群組成的主成分分析。（E）在NR和R患者進行菊粉干預期間，所選屬的變異PLS-DA分析。（F）干預3個月後最有區別的屬的變異。（G）干預前，NR和R患者所有屬的PLS-DA。（H）在NR和R患者中，基線時選擇的細菌屬的相對丰度。

討論

菊粉型果聚糖可作為具有益生元特性的有趣膳食纖維，因為許多動物數據和一些菊粉干預研究均支持其對體重和肥胖相關疾病的潛在的治療效果。菊粉干預後與腸道菌群變化之間的聯繫仍不明確。先前的研究表明，接種健康瘦人糞便後，短鏈果聚糖降低無菌小鼠的體重增加、脂肪量積累和盲腸含量增加。作者認為，這些結果可能取決於用於接種的人體腸道微生物群。我們研究中表明，在定植不同肥胖患者糞便中的“人源化”小鼠中，菊粉反應差異很大，這為干預前腸道微生物群的組成影響健康結果提供了證據。為此，給小鼠接種來自不同肥胖供體的樣品，即使當小鼠表現出相同的飲食行為時，菊粉也會對HFD的hum-ob小鼠體重增加產生不同的影響。菊粉對脂肪組織、肝臟和骨骼肌的代謝變化有不同的調節作用。最後，在hum-ob小鼠中觀察到的個體間差異伴隨著菊粉伴隨特定的腸內菌群的變化。

在兩組小鼠（D2和D3）中，菊粉沒有作用，而另外兩組（D1和D4）中，菊粉有積極的作用，D1中代謝改善更顯著。接受糖尿病供體（D1）和糖尿病前前期供體（D4）腸道菌群的兩組小鼠對菊粉響應者，但是接受另一位糖尿病供體（D2）糞便的小鼠對菊粉的補充沒有反應，這表明

在D4小鼠中，即使FMT不會加重HFD的影響，菊粉也會改善脂肪量和肝脂肪變性。在這一組中，菊粉優先上調已知的對宿主代謝有益的細菌，如A.muciniphila，在我們的研究中與脂肪肝呈負相關。有研究表明，Akkermansia的施用可以防止肥胖症發生並逆轉HFD餵養小鼠的代謝紊亂。有趣的是，整個隊列的應答者組的特徵是基線時Akkermansia的丰度較高，但干預後其丰度降低。Dao等人也表明，在低熱量飲食干預中，基線時Akkermansia丰度較高的肥胖受試者代謝變化有較大的改善，但在干預期間，這一組的Akkermansia也有所下降。這說明

在D4小鼠中，菊粉還增加了Faecalibacterium spp、Lactobacillus spp和Bifidobacterium spp的含量，與之前的研究結果一致，肥胖和糖尿病患者的prausnitzii F.較低，體重減輕後增加。此外，與安慰劑相比，菊粉型果聚糖干預增加肥胖婦女隊列中的Bifidobacterium spp 和 Faecalibacterium。最後，在對乳酸菌的益生菌干預研究中也觀察到肥胖和代謝紊亂的改善。

菊粉在D1和D4 hum-ob小鼠中的生物學效應具有一些相似之處，但並非全部。菊粉通過降低兩組中srebp1和srebp2蛋白的核表達以及脂肪形成基因的mRNA表達降低肝脂質含量。先前的數據顯示，在小鼠中，經過簡化的人類腸道菌群定植和菊粉處理後，涉及脂肪生成、FA伸長和去飽和的基因減少。在D1小鼠中，我們發現這些變化可以通過菊粉調控肝ACC磷酸化來調節，控制FA的合成和氧化。然而，在D4小鼠中，其機制似乎與ACC無關。這表明菊粉干預可能會促進脂肪變性和肝病的改善，但是取決於最初的微生物組，其背後的分子機制可能不同。僅在D1 hum-ob小鼠中觀察到肌肉甘油三酯含量降低和胰島素敏感性改善，證實兩個應答組之間的應答模式不同。再次，將腸道微生物變化與菊粉反應聯繫起來顯示，Butyricimonas，Victivallis和Bilophila與肌脂肪病呈正相關，D1小鼠中有3個屬因菊粉減少。

在我們的研究中，chao1豐富度指數在基線時是相似的，菊粉在hum -ob小鼠和人類群體中都沒有改變它。先前的研究表明，在健康人中，最初的糞便雙歧桿菌數量與菊粉或富含低聚果糖的菊粉導致的雙歧桿菌增加量之間呈反比關係，表明菊粉可能在基線時雙歧桿菌含量較低的個體中引起更大的代謝反應。在我們的人類隊列中，應答者中雙歧桿菌屬的基線水平並未降低。實際上，在有應答者和無應答者之間，只有3個屬在基線上有顯著差異，即使基線上的其他細菌似乎推動了兩組之間的分離。我們認為，響應的幅度可能受到同時受益生元影響的一部分細菌（而不是一種特定細菌）的影響。與此相符的是，Zhao等人證明了一組短鏈脂肪酸（SCFA）產生細菌被膳食纖維促進，並且是改善宿主血糖控制的關鍵。他們鑑定15個產SCFA菌株，分別屬於Faecalibacterium、Lactobacillus、Bifidobacterium和Ruminococcus屬，這些菌株一方面可以發揮有益的作用，另一方面可以阻止有害細菌。因此，我們在一組應答小鼠中發現prausnitzii、Lactobacillus spp和Bifidobacterium屬的增加。

目前的數據表明，腸道菌群的特異性驅動著對菊粉的代謝和微生物反應。選擇一種特定的營養策略來處理非酒精性脂肪肝、葡萄糖穩態或肥胖，不僅需要關注最初的腸道菌群，還需要關注腸道菌群被特定的益生元充分修飾的能力。

這意味著成功的飲食干預（即益生元）必須被視為改善代謝健康的工具之一，但患者的積極性仍然至關重要。我們研究的侷限性可能是所有人類捐贈者都是女性，而糞便移植僅在雄性小鼠中進行。這是由於之前所有在HFD小鼠中測試菊粉的實驗都是在雄性小鼠中進行的，雄性小鼠比雌性小鼠更容易出現代謝紊亂。此外，在人群隊列中，菊粉治療對BMI的改善沒有性別差異。

總之，應該為益生元干預開發個性化方法，以針對傾向於產生良好反應並避免不利結果的肥胖患者為目標。在這個複雜的生態系統中，識別菌群是驅動對益生元代謝反應的重要因素，可以給肥胖症患者代謝紊亂的個性化管理提供充分的營養建議。

評論

腸道菌群可作為代謝紊亂的治療靶標。菊粉作為益生元可減輕肥胖症和相關疾病。本文研究干預前腸道菌群的特徵是否決定了對菊粉的生理反應。發現從不同肥胖個體中獲得糞便菌群的hum-ob小鼠對高脂肪飲食中菊粉的補充有不同的反應。在hum-ob小鼠中觀察到幾個細菌屬，Barnesiella, Bilophila, Butyricimonas,Victivallis,Clostridium XIVa, Akkermansia, Raoultella 和 Blautia與代謝結果（肥胖和肝脂肪變性減少）相關。該研究表明選擇一種特定的營養策略來處理非酒精性脂肪肝、葡萄糖穩態或肥胖，不僅需要關注最初的腸道菌群，還需要關注腸道菌群被特定的益生元充分修飾的能力。在這個複雜的生態系統中，識別菌群是驅動對益生元代謝反應的重要因素，可以給肥胖症患者代謝紊亂的個性化管理提供充分的營養建議。

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關鍵字: 腸道 SAT 小鼠