在1/3的人类癌症中，3个RAS基因（HRAS，NRAS和KRAS）会发生突变，因而被称为原癌基因。有趣的是，RAS突变模式截然不同：不同癌症中突变类型以及取代的位置和类型各不相同。由于RAS是多种癌症中最早发生突变的基因之一，因此探究这些突变模式如何产生不仅可以了解癌症的发生方式，而且可以了解影响影响该事件的因素，这对癌症的预防具有重要意义。
2018年，杜克大学药理学和癌症生物学学系的Christopher M. Counte教授在《自然综述·癌症》提出一个观点：他们认为正常细胞中致癌RAS信号促进肿瘤的发生存在一个狭窄的窗口或平衡点。因此，每个正常细胞中的RAS突变模式都是特定RAS亚型突变的产物，以及突变的位置和替代类型，以达到理想的信号水平。
A model for RAS mutation patterns in cancers: finding the sweet spot
RAS家族属于小GTPases，包含三个人类基因HRAS、NRAS和KRAS，分别编码四种蛋白HRAS、NRAS、KRAS4A和KRAS4B，后两种KRAS异构体是可变剪接引起的（图1a）。RAS蛋白主要存在于质膜的胞质侧，但也可以通过羧基末端添加特定脂质部分而定位到其他膜部位，例如高尔基体膜（HRAS和NRAS）和内体膜（HRAS和KRAS）。当受体酪氨酸激酶激活时，通过募集到质膜上的RAS鸟苷酸交换因子（GEF）将RAS从GDP结合的失活状态转换为GTP结合的激活状态。GTP结合的RAS构象发生改变，其RAS结合域（RBD）可以结合大量蛋白质（效应物），研究最多的是MAPK途径的RAF激酶，PI3K的p110亚基和RAL GEFs，它们通过一系列信号促进细胞增殖。通过与RAS GTPase激活蛋白（GAP）结合而终止信号，GAP会加速RAS的GTPase活性，使RAS循环到GDP结合的失活状态（图1b）。而在1/3的人类癌症中，RAS的单个点突变可以逃避这种精巧的信号转导。这些点突变大多数会改变氨基酸G12、G13或Q61，从而导致内在和/或GAP刺激的GTPase活性丧失，特别是，G13和Q61处的突变（而非G12）会增加内在的和GEF介导的鸟苷酸交换速率。因此，RAS优先与GTP结合处于活性状态，这已经被证实具有致癌性（图1c）。
RAS亚型和信号概述
RAS肿瘤生物学中最有趣但尚未解决的临床问题之一是，在人类癌症中RAS同工型突变以及突变的取代位置和类型不同。关于同工型突变，KRAS在近四分之一的癌症（主要是腺癌）中发生了突变。NRAS在<10％的肿瘤中发生突变，但在某些癌症（例如黑素瘤或某些白血病）中发生率很高。 HRAS总体上突变频率相对较低，主要发生在鳞状上皮癌中。就突变位点而言，胰腺导管腺癌（PDAC）中，KRAS中90％的致癌突变发生在G12，而在黑色素瘤中，NRAS中近90％的致癌突变发生在Q61。尽管在PDAC和非小细胞肺癌（NSCLC）中KRAS都在G12处突变，但在胰腺癌中主要是G12D突变，而在肺癌中是G12C（图2）。这些模式表明了肿瘤生物学的一些潜在基本特征，但是又是什么呢？ 本文中，Christopher M. Counte教授认为RAS突变模式是（至少部分是）肿瘤发生过程中选择理想信号水平的产物，这取决于RAS突变的功能变化、RAS蛋白水平和细胞对致癌RAS的反应。了解这些选择性压力可能会揭示肿瘤的发生过程，对癌症预防具有重要意义。
人类癌症中三种RAS基因致癌突变的频率和类型
RAS突变的时间问题
这些突变模式的一个线索是时机选择，或者更具体地说，RAS何时发生突变。RAS突变可能是肿瘤发展中的起始事件，早期证据来自对化学致癌物诱导的啮齿类哺乳动物或皮肤肿瘤的分析。 由甲基亚硝基脲（MNU）或DMBA治疗引发的肿瘤始终显示出RAS基因的激活突变，并且在每种情况下，突变取决于起始化学物质的特征。此后已在胰腺、肺和皮肤的癌前病变中检测到KRAS或NRAS的突变。人类原发性PDAC或NSCLC肿瘤不同区域的全外显子组测序显示，尽管肿瘤内存在遗传异质性，但在不同区域KRAS突变始终存在，这支持早期起源假说。在小鼠中，由致癌物氨基甲酸酯或MNU诱导的肺部病变的外显子组测序显示只有一个复发性突变——Kras。实验中，向小鼠内源性Kras、Nras或Hras等位基因引入致癌突变可诱导多种组织的癌前病变或低度病变，这些组织单独或在抑癌基因失活后会发展为明显的癌症。总而言之，这些发现支持RAS基因是各种癌症中最早（即使不是第一个）发生突变的基因。
RAS和正常细胞
在完全发展的肿瘤中，这些肿瘤在潜在的数十年发展过程中经历了多种遗传和表观遗传学变化，塑造RAS基因突变模式的因素可能会丢失或被掩盖。因此，了解RAS突变模式的关键可能在于突变首次在正常细胞中发生的时间。聚焦于在没有其他干扰的情况下体内正常细胞中致癌RAS的作用，激活小鼠Kras致癌等位基因可以导致增殖或某些组织器官衰老过程中的增殖，但对其他组织没有明显作用。
在激活致癌的Nras或Hras等位基因后也观察到了不同的反应，这种差异作用可以在细胞水平上体现出来。在胰腺、肺或毛囊的某些细胞类型中激活致癌的Kras等位基因具有致癌性，而在同一组织中的其他细胞类型则不敏感。实际上，在两个模型中Kras的全面激活会导致一组明确的癌症，其结论是，在没有其他干扰的情况下，Kras的激活突变并不是普遍致癌的。同样，在早期干细胞群体中激活RAS可能会导致肿瘤发展为恶性肿瘤，而无需进一步干预，而在分化程度更高的细胞中激活相同的癌基因可能需要额外的刺激，例如暴露于炎性因子下才能发展，以发展为癌前病变。了解RAS会引起哪些反应以及为什么会发生，应该可以深入了解RAS突变模式的根本原因。
“平衡点”模型
RAS基因的一个有趣的地方是，每个异构体的密码子使用不同，蛋白质表达也相应不同。在基因中经常出现的密码子被称为普通密码子，与强大的mRNA翻译有关，而那些很少见的密码子被称为稀有密码子，翻译质量较差。小鼠和人的HRAS cDNA富含普通密码子，并表达高水平的异位蛋白；NRAS是普通密码子和稀有密码子混合，蛋白表达水平处于中间，而KRAS则富含稀有密码子且翻译不佳。将小鼠内源性Kras基因的一个外显子（Krasex3op）中的稀有密码子变为普通密码子会增加KRAS蛋白的水平，从而使小鼠对致癌物氨基甲酸酯诱发的肺部肿瘤更具抵抗力。此外，除了在尿烷诱发的肿瘤中发现的Q61R或Q61L（Q61R/L）Kras突变，在Krasex3op等位基因中还恢复了G12D突变。与原发性肺成纤维细胞中的G12D突变相比，KRAS中的Q61R/L突变激活MAPK途径的程度更高，当引入Krasex3op cDNA时，该突变诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16INK4A表达（衰老生长停滞的marker）。总的来说，这些发现表明，表达水平较低的天然Kras等位基因中的“强” Q61R/L突变，至少在肺成纤维细胞中的MAPK活化方面，会诱导增殖，而表达水平较高的Krasex3op等位基因中的Q61R/L突变则诱导衰老，并在肿瘤中无法恢复。支持这些发现的是，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（Cdkn2a）基因（在小鼠中编码p16INK4A和p19ARF）失活以钝化癌基因诱导的衰老，在尿烷治疗的小鼠中导致了相似数量的肺部肿瘤，不论Krasex3op等位基因的数量多少。相比之下，在表达不佳的天然Kras等位基因中，由肺成纤维细胞中MAPK激活“较弱” 所定义的G12D突变很少诱导足够的增殖以引发氨基甲酸酯致癌模型中的肿瘤发生，直到这种突变在高表达的Krasex3op等位基因中发生，超过阈值形成肿瘤（图3）。
RAS突变模式的“平衡点”
这些发现表明，致癌RAS信号传导引起肿瘤形成有一个狭窄的窗口或“平衡点”。过多会导致生长停滞，而信号过少则会导致细胞无法增殖。RAS致癌信号转导的平衡点在不同细胞类型中可能有所不同。这样，RAS亚型突变的差异以及癌症之间突变的位置和类型，将是针对特定来源细胞中理想信号水平选择的产物。
RAS突变不尽相同
RAS亚型中最常突变的三个密码子（12、13和61），都会影响GAP介导的GTP水解，从而使RAS优先与GTP结合并具有活性。每种突变如何实现这一过程并不相同，其中的机制先前已有综述。这些位置上的取代性质也会影响该循环，而且，这不仅仅是破坏GTPase活性的问题。致癌突变也可能影响与RAS GAP、RAS GEF和效应器的相互作用，这一方面先前已有综述。一个典型的例子是，Q61L和G13D突变而非G12V突变会加速内在的和GEF介导的鸟苷酸交换。另一个例子是，G12V和G12D突变均降低了对效应器RAF的亲和力，但G12V会比G12D更好地激活RAF，因为它更有效地降低了GTPase活性。
RAS信号强度的变化
RAS信号过多
过多的RAS可以抑制肿瘤发生的概念可以追溯到最初的发现，即RAS异位表达诱导人和啮齿动物原代细胞衰老，随后的发现是在激活内源性Kras癌基因后在小鼠组织中检测到衰老marker。更直接的证据来自调节小鼠乳腺中Hras-G12V转基因的水平。低水平促进局灶性上皮增生，而高水平引起衰老并抑制导管伸长。同样，敲入Kras基因座的Cre可诱导的Hras-G12V cDNA的激活在小鼠的肺部不是致瘤的。 在小鼠肺中激活可诱导的Kras-G12V等位基因导致有限的肺部增生，但在不存在Braf等位基因的情况下，与可诱导Braf-D631A等位基因共激活，可有效激活MAPK途径，阻断肺泡病变的发展并引起DNA损伤。重要的是，通过中间剂量的MEK抑制剂降低MAPK信号传导会恢复肿瘤进展。同样，小鼠肺中诱导Braf-V600E和Kras-G12D等位基因的同时激活导致信号传导，会引起衰老marker的升高、肺肿瘤发生的减少。
为了进一步证实过多的癌基因信号转导的有害作用，通过干扰双重特异性蛋白磷酸酶6（Dusp6）基因破坏负反馈，前B细胞中NrasG12D的激活会导致ERK超活化、大量衰老和白细胞减少。但是，并非所有细胞都具有这种敏感性，因为在某些造血系统中，NrasG12D的两个等位基因比一个具有更高的致癌性。
总体而言，在正常细胞中操纵内源性致癌RAS信号的多个体内实例支持以下论点：过多的致癌RAS信号无法支持肿瘤的发生。但RAS信号的多少在不同组织和细胞中式不同的。
RAS信号过少
使用Cre诱导的绿色荧光蛋白（GFP）标记重组的阳性细胞，表明尽管Cre诱导的Kras-G12D等位基因在小鼠的整个细支气管和肺泡中广泛表达， 只有II型肺泡细胞会引起腺癌。尽管GFP等位基因的重组可能不一定与KrasG12D等位基因的重组相关，但是当共表达功能低下的Braf突变体或药理学抑制RAF诱导MAPK通路的反常激活赖增强RAS致癌信号转导时，会引起支气管细胞增生，这提示肿瘤起始所需的细胞类型特异性信号传导阈值。在这方面，更令人信服的实验可能是采用Cre诱导的Kras-G12V-IRES-β-geo等位基因的实验，该等位基因可生成编码Kras和β-geo的mRNA，后者可通过X-gal染色进行观察。该等位基因在小鼠睾丸、肾脏、小脑、肝和肠中的激活揭示了形态正常的β-geo+细胞，没有增生性增长的证据，但需要注意的是，IRES–β-geo的存在可能会干扰RAS表达并影响表型。
因此，在正常细胞中没有其他干扰的情况下，操纵内源性RAS信号的多个体内例子支持这样一种观点，即最低水平的致癌RAS信号对于肿瘤的有效起始是必需的，但这又会因细胞而异。
RAS水平的变化
鉴于上述证据表明，致癌RAS信号要么太强，要么太弱，都无法诱导肿瘤发生，那么问题就变成了在获得致癌RAS突变后，是什么决定了正常细胞中会发生哪种结果。通常，任何影响RAS蛋白水平的事件都可能影响细胞对RAS的反应。在这方面，RAS基因具有不同的启动子，可能会影响转录并最终影响蛋白质水平。
在小鼠中，在15个成年组织中通过实时定量PCR测定mRNA水平，Kras4b >> Nras ≥ Kras4a > Hras，其中Kras4b占所有RAS mRNA的70–99％。与此一致，肺通常是小鼠自发肿瘤的一个部位，而Kras是这些肿瘤中突变的主要RAS同工型。但是，这种相关性不适用于肝脏，即自发性肿瘤的另一个常见部位，其中Hras是突变的主要RAS基因。进一步使事情复杂化的是，整个组织中的mRNA水平可能不代表原发癌细胞中的表达。确实，对来自野生型Hras基因座的表达β-geo蛋白的Hrasβ-geo小鼠的检查显示，X-gal染色在多种测试组织中不均匀。尽管基因表达肯定会影响蛋白质水平，但是这在三个RAS基因的背景下仍有待充分探讨。
总结
可能影响特定RAS突变是否导致肿瘤发生的多种因素使弄清人类癌症中的RAS突变模式极为复杂（图4）。
导致癌症中RAS突变偏倚的因素
一般而言，建立有效的致癌性RAS突变的基础的原理可以应用于其他引发肿瘤的情况。其他癌症驱动基因不仅在突变的同工型（例如，BRAF是人类癌症中三种RAF异构体中最常见的突变）存在变异，而且突变的位置（例如，BRAF-G469突变在黑色素瘤很少见，但在肺腺癌中常见）以及取代类型（例如，脑癌中主要的IDH1突变是R132H，而在黑色素瘤中，R132C）也存在变异，这与RAS突变是一致的。
作为信号强度如何塑造突变模式的一个例子，在NSCLC中，RAS依赖性低活性的BRAF突变体比活化的RAS非依赖性的BRAF突变体更常见。这些机能减退的突变也很少与RAS突变或编码GAP212的神经纤维蛋白1（NF1）缺失或突变同时发生。在黑色素瘤中，情况相反，活化的非RAS依赖性BRAF突变体占主导地位。当检测到低活性的BRAF突变体时，它们总是与RAS或NF1突变同时发生。这些发现表明，与肺不同，黑素细胞中的基础RAS激活水平太低，无法与BRAF突变相关。
除引发肿瘤外，关键信号输出的概念还可应用于其他方面，例如在耐药性方面。一个典型的例子是结直肠癌，其中KRAS中最常见的突变通常在G12位，但是对表皮生长因子受体（EGFR）治疗获得性耐药的患者存在丰富的Q61突变。类似地，在BRAF抑制剂vemurafenib耐药的BRAF-V600E黑素瘤患者中检测到MEK1突变体表达后，BRAF-V600E黑素瘤细胞系可在BRAF抑制剂存在下达到最佳生长。另一个例子是使用vemurafenib来抑制BRAF突变肿瘤的生长。这些患者由于RAF1的反常激活而发展为皮肤鳞状癌，几乎导致仅有HRAS-Q61L突变的鳞状肿瘤。这些发现提示了在抑制剂存在下实现最佳信号传导的特定突变的选择过程。
总之，信号“平衡点”的概念，无论是信号的水平还是组成，都为解开RAS基因复杂的突变谱以及各种人类癌症环境中潜在的其他驱动突变提供了一个方向。
参考资料：Li, S., Balmain, A. & Counter, C.M. A model for RAS mutation patterns in cancers: finding the sweet spot. Nat Rev Cancer 18, 767–777 (2018).
