銅綠假單胞菌是一種革蘭氏陰性菌、好氧、呈長棒形的細菌。銅綠假單胞菌是一種主要致病菌，患囊腫性纖維化、燒傷、獲得性免疫缺陷綜合症和癌症的住院病人易嚴重感染本菌。銅綠假單胞菌最令人擔憂的一點是極易產生耐藥性，這是由於抗生素耐藥基因（如mexAB、mexXY等）能編碼多重耐藥泵，以及菌的膜通透性低。由於多重耐藥（MDR）、廣泛耐藥（XDR）和泛耐藥（PDR）的菌株不斷湧現，這給抗菌治療帶來了嚴峻的挑戰。大量的研究聚焦於銅綠假單胞菌感染機制的分子基礎和開發防治感染的新方法。同時，銅綠假單胞菌是生物膜形成、群體感應、藥物靶點和代謝工程研究的模式生物。
銅綠假單胞菌的研究熱點
基於CRISPR/Cas 9的基因組編輯將加速對銅綠假單胞菌的多功能研究。
基因組、蛋白質組和生物學 | 細胞外基質的代謝和維持 | 耐藥性 | 分泌系統 | 細胞極性和上皮屏障
CRISPR-B™ 高效編輯銅綠假單胞菌
基因編輯通常會徹底改變對微生物物種的理解、開發和控制。銅綠假單胞菌是生物膜形成、群體感應、藥物靶點和代謝工程研究的模式生物。然而，傳統的銅綠假單胞菌遺傳操作方法需要多步選擇才能產生突變體，並在缺失基因的地方留下疤痕序列。因此，傳統的方法仍費時費力。
源井生物研發的CRISPR-B™可高效編輯銅綠假單胞菌的基因。利用CRISPR/Cas9和λ-Red重組系統，可實現銅綠假單胞菌快速、精確、無縫的基因編輯操作。源井生物可以定製銅綠假單胞菌的基因編輯，以及微生物中的各種基因修飾。
使用CRISPR/Cas9對微生物進行基因編輯，助力抗菌藥物開發
硝酸鎵（Ganite）是治療銅綠假單胞菌感染的潛在藥物。基於CRISPR/Cas9的基因突變研究表明，鐵載體pyochelin介導和ABC轉運體是銅綠假單胞菌Ga3+內化的兩個主要途徑。研究者揭示了Ga3+能抑制銅綠假單胞菌生長和生物膜形成。
銅綠假單胞菌利用pyochelin介導和ABC轉運體通路攝取Ga3+和Fe3+的示意圖
硝酸鎵能改善CF和慢性銅綠假單胞菌肺部感染患者的肺功能，且無任何嚴重不良反應，該結果顯示硝酸鎵具有治療銅綠假單胞菌感染的潛在臨床應用價值。
為了研究銅綠假單胞菌攝取鎵的分子機制，研究人員利用CRISPR/Cas9技術，對銅綠假單胞菌模型菌株PAO1中的關鍵基因進行突變，以分別阻斷鐵的吸收途徑。研究中共構建了5個不同的PAO1突變體，（1）PAO1ΔhitA突變體阻斷經典的高親和力鐵吸收系統ABC轉運蛋白，兩個突變體（2）PAO1ΔpvdA和（3）PAO1ΔpchF分別阻斷了兩個鐵載體PVD和PCH的生物合成途徑，（4）PAO1ΔfeoB突變體失去了高親和力的內膜鐵離子轉運體，（5）PAO1Δtesf突變體取消了Tesf介導的鐵吸收途徑。
圖1：銅綠假單胞菌突變體的測序結果
研究人員通過測定在缺鐵培養基中Ga(NO3)3對不同菌株的最低抑菌濃度（MICs），分析Ga（III）對野生型（WT）和不同PAO1突變體生長的影響。他們還分析了不同的鐵吸收途徑對PAO1和PAO1Δtesf突變體攝取鎵的影響。在這個雙突變株中也觀察到細胞內鐵水平的顯著下降（圖3B），這表明HitABC轉運體是銅綠假單胞菌鐵攝取的主要貢獻者。
圖2：Ga(NO3)3對野生型銅綠假單胞菌及其不同突變體的MIC值。
圖3：銅綠假單胞菌及其突變體細胞內鎵含量（A）和鐵含量（B）。
HitA是一種存在於細菌周質中的可溶性鐵結合蛋白，與單個Fe3+具有很高的親和力。HitA在Ga3+攝取過程中也有類似的作用。為了揭示這一現象，他們應用細胞熱位移分析（CETSA）觀察到Ga3+可以在體內與HitA結合。隨後，他們進行了金屬競爭試驗，觀察到Fe3+可以很容易地從Ga3+-HitA蛋白中取代Ga3+。研究人員生成了apo-HitA和Fe3+結合以及Ga3+結合的HitA蛋白的高分辨率晶體結構。Ga3+-HitA的結構與Fe3+-HitA相似，Fe3+的配位球與Ga3+位點上確定的幾乎相同，因此證實Ga3+可以模仿Fe3+佔據HitA的金屬結合位點。
圖4：一個不對稱單元上兩個Fe3+-HitA和Ga3+-HitA鏈的疊加。金屬配位球在兩條鏈上是相同的。
本研究為銅綠假單胞菌內化Ga3+提供分子機制，促進了鎵類抗菌藥物的開發。
源井生物自主研發的CRISPR-B™技術優化了微生物基因編輯載體及過程。其效率和準確度是傳統方法的20多倍。該技術可以廣泛應用於細菌和真菌的基因編輯。
參考文獻：
Identification and characterization of a metalloprotein involved in gallium internalization in Pseudomonas aeruginosa. ACS Infect Dis 2019, 5(10):1693-1697.
Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions. Front Microbiol 2012, 3:20
作者 | By Dr. ASAD UZZAMAN
文章是源井生物原創，轉載請註明！
