賓夕法尼亞大學醫學研究人員在《科學進展》(Science Advances)網站上發表的一項新的概念驗證研究報告稱，一項新的CRISPR基因編輯技術可預防已知由數百種不同突變驅動的遺傳性肝病，並改善了小鼠的臨床症狀。這些發現表明了一種很有前途的CRISPR工具，它可以潛在地治療一種罕見的代謝性尿素循環疾病，這種疾病是由缺乏鳥氨酸氨甲酰轉移酶(OTC)引起的，以及由同一基因的不同突變引發的其他遺傳性疾病。
CRISPR方法是建立在賓夕法尼亞醫學院之前開發的一種方法的基礎上，該方法僅限於糾正一種突變——它對新生的小鼠有益，但對成年小鼠無效。這一次，這項技術使用了一種新型的雙腺相關病毒載體(AAV)來傳遞其成分，將一種“迷你基因”插入到基因組中，以一種被稱為“剪切”和“粘貼”的方法來實現OTC在肝細胞中的持續表達。沒有突變被糾正，而是一組新的指令被添加到細胞中。結果，研究人員觀察到新生小鼠的臨床受益持續到成年。
“就像大多數對新生兒造成致命影響的遺傳疾病一樣，長期有效的早期治療至關重要。”醫學教授、賓夕法尼亞大學基因治療項目和孤兒疾病中心主任、醫學博士詹姆斯·威爾遜(James Wilson)說。“在此，我們提出了一種CRISPR方法，不僅可以在細胞中維持OTC的表達，還可以拓寬該工具的功能。我們的目標是最終將這種基因編輯方法從動物身上應用到治療OTC疾病和其他基因疾病上，這些疾病是由分散在整個基因中的突變引起的，而不是單一的顯性突變。”
在近四萬分之一的新生兒中發現，OTC紊亂可能源於OTC基因的300多種不同突變。由於這些突變發生在X染色體上，通常在男性身上發現，而女性是攜帶者。尿素循環是一系列六種肝酶，幫助人體排出氨。當其中一種酶缺失或缺乏時，氨就會在血液中積聚並進入大腦，從而導致大腦損傷甚至死亡。為了治療這種疾病，患者服用藥物來刺激替代的氮清除途徑，或者在嚴重的情況下，進行肝臟移植。然而，這些患者的死亡率仍然很高，因此需要更新、更有效的治療方法。
為了開發一種廣泛應用的基因組編輯工具，該團隊構建了一個新的雙AAV載體，其中包含一種被稱為Cas9的RNA引導的細菌蛋白，這是一種快速、可靠的方法來發現和操作細胞中的基因。這種Penn開發的載體被稱為AAV8，它特別與肝細胞有親和力。第二個AAV包含一個功能完整的“迷你基因”，該基因表達一種編碼優化的人類OTC (供體DNA)，由一種肝臟特異性啟動子驅動，以確保它在注入血液時只在肝細胞中表達。
第一步是Cas9沿著基因的靶向位點在DNA中產生一個斷裂(“剪切”)，這為在所謂的同源定向修復或HDR(“粘貼”)中添加迷你基因奠定了基礎。
“與其它刪除或修改部分正常基因的CRISPR方法不同，這項技術整合了新的部分。”第一作者、醫學研究副教授Lili Wang博士說。“我們不是在試圖糾正阻止肝細胞產生OTC的突變，我們是在添加這種新的迷你基因，這樣細胞就可以產生OTC。”
靶向載體處理的小鼠在3周和8周時肝臟中分別顯示出25%和35%的OTC表達細胞，分別是非靶向載體處理小鼠的4倍和3倍。在這兩個時間點上(3周和8周)，大多數OTC陽性的肝細胞分佈在靶向小鼠肝臟的各個部位。
研究人員還觀察到，與未服用高蛋白飲食的小鼠相比，服用高蛋白飲食的小鼠的氨水平降低了60%，這一臨床跡象表明，肝細胞正在產生OTC。
“通過這些成功的動物研究，我們已經接近一種潛在的‘廣譜’基因編輯方法來治療OTC缺陷的患者，而不考慮突變和臨床狀態。”Wilson說，“下一步說通過更多的臨床前研究，在人類肝細胞的基因上找到一個安全的避風港，然後測試類似的基因編輯方法。”
原文來源：https://medicalxpress.com/news/2020-02-crispr-minigene-approach-genetic-liver.html
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