以下文章來源於龍沙生物製藥 ，作者Lonza龍沙
製藥行業逐漸聚焦於開發下一代藥品，包括靶向傳遞多重功效的活性成分，可以提高療效和安全性。本文作者，Lonza龍沙細胞和分子生物學家Sweeney博士認為，雙特異性抗體和多特異性抗體就是重要的新藥研發方向之一，這類藥物具有全新作用機制，療效更優，同時還可以降低藥物開發成本，縮短藥物開發週期。
市場增長，帶動研發熱情高漲
目前，市場上有兩款獲美國FDA批准的雙特異性抗體（BsAb）產品：Fresenius Biotech和Trion Pharma聯合開發的Removab（卡妥索單抗），用於治療惡性腹水，以及安進開發的Blincyto（倍林妥莫雙抗），用於治療復發/難治性急性淋巴細胞白血病的。如今，全球有超過85個雙特異性抗體處於臨床開發階段，而且這個數字還在不斷增長[1]。
學術界和工業界的研究人員都在積極推進新的雙/多特異性抗體結構，速度遠比常規單克隆抗體（mAb）快得多[2]。總體而言，到2025年，雙特異性抗體研發管線的增長速度可以達到常規單抗藥物的三倍，其中大多數雙特異性抗體針對的適應症都是癌症[3]。到2025年，隨著全新雙特異性抗體進入市場，同時已上市雙特異性抗體獲批更多適應症，雙特異性抗體的全球市場規模預計將超過80億美元[4]。
雙/多特異性抗體的優勢
相比傳統單抗，雙特異性抗體的優勢在於更加精準靶向和更強治療效果，這也充分激發了研發熱情[5]。雙特異性抗體通過設計，可以與兩個不同抗原相結合，或與同一抗原的不同表位相結合。抗體和抗原的結合位點/相互作用位點緊密接近，可以使抗體和抗原形成新的蛋白複合物，並觸發新的細胞接觸[6]。通常情況下，增強效果比兩個單藥的聯合治療要更明顯。雙特異性抗體還可以針對新的治療靶標或單抗無法實現的靶標組合。
由於雙抗或者多抗有著兩個或多個位點與靶細胞交互作用，可實現更多靶向結合，並通過重定向具有細胞毒性的免疫效應細胞來激活更多免疫反應，例如T細胞和自然殺傷（Natural Killer）細胞的重定向可以產生更顯著的靶向細胞毒性效應[7]。另外，雙特異性抗體可同時在單一疾病通路或不同級聯信號中充當兩種蛋白質的抑制劑。在多結合位點和不同通路的參與之下，還可以降低出現耐藥性的幾率[8]。
與自體嵌合抗原受體（autologous chimeric antigen receptor）T細胞療法相比，多特異性抗體設計成T細胞銜接子更具優勢，除了無須定製之外，也不會產生異體細胞療法相關免疫原性反應[9]。
截至2019年中，全球已有20多種雙特異性抗體開發和生產的商業化技術平臺。
形式多樣的分子結構
隨著蛋白質工程技術的不斷進步，雙/多特異性結構類型也越發多樣：重鏈和輕鏈以不同數量和不同形式組合形成各式各樣的分子結構。一般來說，雙特異性抗體根據是否包含可結晶片段（Fc）進行分類，藥代動力學、半衰期、Fc受體介導功能（如適用）和生物學活性等也會因分子結構而有顯著差異。
有些雙/多特異性抗體在設計時，會改進效應子功能或延長半衰期，與傳統單抗類似。有意思的是這類二代產品還是針對老靶點。有些雙/多特異性抗體有其他結合位點，靶向專一性更強，可實現新的作用機制[9]。還有一些雙/多特異性抗體基於抗體片段或其他蛋白骨架連接。其餘的則包括抗體和其他分子偶聯，如抗體偶聯藥物。
我們還可將不同抗原結合位點（如scFv或Fab）與其他蛋白結構域融合產生雙特異性抗體，從而進一步功能化[6]。如今，臨床試驗中大多數候選藥物都是BiTE、DART、同二聚體“杵臼結構”("knob-in-hole")抗體或三功能性雙特異性抗體[8]。
形式多樣的生產工藝
截至2019年中，已有20多種商業化技術平臺開發和生產雙特異性抗體。Amunix、Invenra、Glycotope、Xencor、諾華、第一三共和羅氏等企業目前都在努力簡化雙/多特異性抗體開發流程，提高患者安全性，並增強療效[9]。
雙特異性抗體生產平臺主要使用哺乳動物細胞。但分子量較小（<50 kD）且結構較簡單的雙特異性抗體，如Fab片段，不涉及Fc區域或無須糖基化，使用大腸桿菌生產可能是最佳選擇。目前，使用酵母（尤其是畢赤酵母）生產雙特異性抗體也逐漸引起關注，尤其是對於無須翻譯後修飾且分子量稍大的分子。
早期雙特異性抗體是通過融合兩種雜交瘤細胞系產生四源雜交瘤，但這種工藝會使得重鏈和輕鏈隨機結合，導致所需組合僅佔一小部分。杵臼結構技術，通過在一端引入“杵狀結構”並在另一端引入“臼狀結構”形成異二聚體，解決了重鏈錯配問題。
如今，大多數雙特異性抗體使用交聯劑通過化學偶聯/共價鍵合產生，雜交瘤細胞系融合成四源雜交瘤，或者使用基因工程技術生產包含親本單抗的VH和VL結構域的重組雙特異性抗體片段。根據組成和所用技術，它們在抗原結合位點的數量、立體構型、血清半衰期和效應子功能方面會有所不同。
生產面臨的諸多挑戰
雙/多特異性抗體結構類型的複雜性對蛋白表達和製造工藝帶來諸多挑戰，包括表達量低、產品質量不穩定和蛋白質聚集等。
龍沙已經開發出一套完整的蛋白表達工具，面對越發複雜的蛋白質結構仍然可以做到穩定高效表達。哺乳動物細胞和微生物表達系統不斷優化，加上專為雙/多特異性抗體量身定製的載體，可實現蛋白表達量高，生產工藝穩定且易於放大。
我們最新版GS基因表達系統GS Xceed®在設計時就已經考慮到了未來的可生產性。該系統可在化學成分明確且不含動物來源成分（chemically defined, animal component–free）的穩健環境中生產出高表達量的產品，且不需要因為穩定性問題而加入甲硫氨酸亞碸亞銨（MSX）。
生產雙/多特異性抗體時使用pXC多基因載體，可以讓第二類限制性內切酶在單個載體上組裝雙/多特異性抗體。位點特異性偶聯載體也可用於簡化抗體偶聯的生產。
最近，我們的工具還增加了一項以轉座子為基礎的技術PiggyBac™，該技術已通過驗證。PiggyBac™優先將大基因物質靶向到高表達基因組穩定區域。龍沙還在評估其他合成啟動子，可以對分子不同組成（VH和VL）的表達進行調整。通過調節不同組成的表達，提高正確配對鏈的比例，有助於克服本文以下敘述的純化和分析問題。
對於某些新的分子類型或組成，微生物系統可能提供更快、更經濟的解決方案。龍沙XS™畢赤酵母表達系統可提供快速組合篩選和直接發酵方案，能夠在較短的總髮酵時間內獲得高表達量（高達10 g/L），從而在10-12周內即可完成基因優化和合成，以及兩步篩選，並生產出mg級目標產品。
對於所有下游工藝，採用平臺解決方案更具挑戰性，必須根據雙特異性抗體的性質進行工藝優化。由於缺少Fc區域，某些雙特異性抗體通常需使用其他樹脂（而不是蛋白質A）。因此，通常需要進行樹脂篩選，且必須投入更多的時間和精力尋找合適的樹脂來純化這些雙特異性抗體。
隨著眾多雙特異性抗體候選藥物進入臨床，生產工藝放大所面臨的挑戰越來越引起關注。實驗室所使用的眾多現有技術均不可放大，技術人員正在努力尋找切實可行的商業化規模生產工藝。
最後，由於雙特異性抗體治療作用較高，因此可能需要替代藥物傳遞方案，如微傳遞系統。
Lonza龍沙正在努力提升技術，積累實戰經驗，滿足下一代治療性蛋白質藥物的生產需求，包括雙特異性抗體。
純化與分析問題
雙/多特異性抗體生產過程中產生的產品相關雜質，其濃度通常比單抗生產過程中的更高，如聚集物和變異體。這些雜質的理化性質與產品本身可能高度相似，如疏水性和淨表面電荷。為了去除這些雜質，一般需要增加層析步驟。但鑑於分子之間的相似性，層析步驟的分離度通常低於單抗生產工藝。為達到目標純度，可能不得不犧牲高產量，而優化這些步驟可能比優化單抗工藝更難。
鑑定產品相關雜質，並明確上清液中有哪些分子，對於開發有效的純化工藝也至關重要。
由於存在眾多重鏈和輕鏈，只進行簡單的凝膠分析是不夠的。因此，質譜分析是必不可少的工具。由於雙特異性抗體的治療作用更高，還要求開發靈敏度更高的分析方法。
分析方法必須專門開發，但是高通量分析能力以及快速分析方法也十分重要。其目標是為分析工作建立平臺解決方案，用於不同雙/多特異性抗體結構類型。
總結
Lonza龍沙目前正在積極拓展各方面的能力，以滿足雙特異性抗體等下一代治療性蛋白質藥物的生產需求。在與眾多合作伙伴開發臨床前項目的過程中，我們發現約三分之二的早期研發管線並不是常規單克隆抗體。我們爭取快速規模化生產原液和成品，從而幫助患者儘早獲得藥品。
此外，開發這些雙/多特異性抗體的公司通常規模很小，包括有志於實踐商業化策略的虛擬研發公司。有些公司並不打算自建生產車間，而傾向於尋找合適的合作伙伴。這樣的合作伙伴不僅可以提供合理的技術解決方案，也能幫助其降低市場準入的風險，並確保隨時提供規模化生產能力。
隨著越發複雜的蛋白質藥物批准上市，雙特異性抗體數量不斷增加，先進的分子生物學和靈活的生產系統是實現商業化的關鍵因素。
作 者 簡 介
Bernie Sweeney博士，龍沙經驗豐富的細胞和分子生物學家，負責開發GS expressionsystems™ 創新技術以及應用。Sweeney博士的團隊是龍沙研發體系重要組成，目前致力於改進哺乳動物細胞和微生物系統中越發複雜的治療性蛋白質藥物（如雙特異性抗體）的可生產性（manufacturability）。
Lonza 龍沙簡介
Lonza龍沙是一家起源於瑞士的擁有百年曆史的跨國企業。龍沙製藥與生物技術業務提供全球化合同定制開發與生產服務（CDMO)，使生物製藥公司能為患者帶來醫學創新。其經營的項目涵蓋從前期臨床開發到商業化生產的全部過程，涉及哺乳動物和微生物的生物製品、小分子、生物偶聯物、細胞和基因療法等領域。截至目前，龍沙已成功幫助客戶從FDA/EMA獲得超過25種生物藥的商業生產批准。
2020年，龍沙位於廣州的生物技術生產基地即將投入運營，提供臨床到早期商業化的開發和生產服務，以應對國內不斷增長的高質量定製的需求。
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