咽拭子採樣：

一次性採樣拭子

檢測之前，我們需要對待檢測的對象採樣，這也是檢測過程中最危險的一步。因為需要和疑似HuanZhe較為親密的接觸。工作人員需要將拭子，就是類似於棉籤的東西，伸入待檢測人員的鼻腔，採集分泌物。過程中，很容易刺激被採集者的過敏反應，咳嗦、打噴嚏，使得分泌物飛濺。所以，做好防護十分重要。

為檢測採樣的工作人員

核酸檢測——樣品處理：

56°C滅火上圖為烘箱滅活

採集好的樣品會被送到專門的檢測實驗室，（至少需要P2級以上的實驗室，空間內為負壓，保證空氣不會外排。）做好標記後，下一步是滅活。由於送來的樣品內病毒尚具活性，所以需要高溫對其滅活，一般56°C，30min即可滅活，水浴，烘箱皆可。（PS：核酸，特別是DNA，短時間內在高溫下結構穩定，56°並不影響核酸結構）

核酸檢測——DNA提取：

滅活之後的樣品，我們需要進一步從中提取其DNA為下一步PCR做準備。這裡需要理解兩個概念：就是新冠病毒的遺傳物質是RNA為什麼我們提取的是DNA？為什麼不直接提取RNA？

首先，就新冠病毒而言，其遺傳物質是RNA，結構類似於mRNA（信使RNA,可以作為翻譯模板）。侵染細胞之後，會通過反轉錄，合成大量cDNA，這樣的cDNA作為模板可以轉錄出大量於侵染RNA一樣的RNA，同時這些mRNA作為模板利用宿主內營養物質合成病毒所需要的蛋白。最後新合成的RNA+蛋白質，即組成新的病毒（F2代）。

其次，利用現在的方法提取到的多是DNA+RNA混合樣，不是單獨一種。常規分子實驗中，為了得到純DNA，會使用Rnase降解RNA；提純RNA後也會利用Dnase降解基因組DNA（DNase I特異降解雙鏈DNA對ssDNA不起作用）。

那麼，對病毒DNA的提取，我們需要三個過程：

1.裂解病毒，打破宿主細胞結構，病毒蛋白結構使得核酸釋放，目前主要的方法是SDS裂解和超聲波破碎。

常見的細胞破碎方法

2.核酸的富集&抽提：利用試劑法，通過苯酚/氯仿/異物醇一類有機溶劑可以去除蛋白質，上清中為核酸水溶液，再用異丙醇or無水乙醇可聚沉核酸。（或者利用試劑盒，通過核酸吸附柱吸附破碎液中的核酸）

吸附柱法核酸抽提過程

3.核酸純化&去離子化：最後一步就是通過高速離心富集後的核酸，通過75%乙醇洗滌，去除核酸沾染的離子，否則會影響PCR反應。吹乾後，加適當的ddH2O即可。低溫保存數月可用。

溶液法和離心柱核酸抽提方法

核酸檢測——qPCR檢測：

幾種冠狀病毒蛋白序列比對

得益於包括武漢病毒所，上海復旦大學等機構在第一時間共享的新冠病毒的核算序列，下游生物公司針對其獨特的序列機構設計了多組特異性的檢測引物：

Q-PCR的檢測和我們平時的常規PCR有什麼區別呢？常規PCR是通過DNA聚合酶，在一對引物的指導下近乎指數擴增目的DNA的過程，結果通過核酸電泳檢測。

PCR原理

VU（左），成像儀（右）檢測核酸的凝膠電泳

而Q-PCR技術是在此基礎上，在反應體系中加入了SYBR、Eva等熒光指示劑，可嵌入DNA雙鏈空隙中，Q-PCR儀上有熒光檢測探頭，每輪延伸反應有會檢測一次熒光值，據此轉化後反饋出Ct值（即達到目標熒光值所需的循環數，循環數越低說明樣品中目標核酸含量越高）。

SYBR Green I

Q-PCR的Ct值定義

通過最後△ △ CT的計算，與陰性樣品（病毒核酸）和陽性樣品（健康人的核酸）的對比，我們就可以知道，所送檢的樣品是否存在病毒感染的問題。

多位點Q-PCR檢測

核酸檢測需要注意的問題：

1.注意樣品之間不要有傳染，否則造成不實結果；

2.實驗過程中做好絕對的防護，即便是失活後的病毒核酸依然不能排除出侵染風險；

3.通過Q-PCR的方法檢測，利用更加精確的Taq MAN探針和髮卡探針等檢測靈敏度更高；

分子信標

4.Q-PCR檢測需要至少兩次以上的重複，同時應該靶標多個病毒特有核酸位點，排除操作誤差和序列同源性。可以做好陰陽性對照；

5.核酸檢測僅能作為患病初期的檢測方法，同時應該注意結合CT結果，觀察檢測對象呼吸細胞情況。

其他核酸檢測方法：

除了上述的靶點式的核酸檢測之外，我國參與過人類基因組計劃的華大基因公司，同時提供了一種基於宏基因組測序（metagenomics Next Generation Sequencing，簡稱“mNGS”，又稱“宏基因組學”）的檢測試劑盒（新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒—聯合探針錨定聚合測序法），能夠鑑別診斷包括新型冠狀病毒在內的其他冠狀病毒和呼吸道病原的感染，實現病毒序列的快速檢測。