皮膚受傷（如撕裂傷或擦傷）後，正常的組織癒合會經歷4個階段，即止血、炎症、增生和組織重塑（成熟期），凝血也可以視為炎症期的一部分。傷口癒合的過程不僅複雜，而且脆弱，容易受到各種因素的干擾而停滯，從而出現慢性傷口【1】。
Figure 1. 慢性傷口中的細菌受到生物膜的保護，誘發和加重炎症反應。抗體和抗生素無法穿透生物膜，且生物膜成為了微生物的儲存庫，不斷造成周圍組織的感染。來源: Biofilms Made Easy. 2010. Wounds International 1(1).
有些傷口會停滯於炎症期（Figure 1）而變成慢性傷口，這些傷口可能會持續數週、數月、甚至數年不愈，同時變得對細菌感染異常敏感。慢性傷口感染構成人類感染性疾病的60-80%，鑑於人類社會人口老齡化和糖尿病、肥胖等疾病患病率的不斷增加，慢性傷口已經成為全球衛生健康的主要問題之一【2】。每20個老人中就有1個罹患由於糖尿病或循環疾病導致的慢性傷口，尤其是那些行動不便、長期使用輪椅或臥床的老年人，更是慢性傷口的高發人群【3】。發生在糖尿病患者的慢性傷口可能是致命的。每年，僅在美國就有超過70000例因為糖尿病相關慢性傷口感染導致的下肢截肢，而這些截肢病人中有大約1半會在手術後18個月內死亡；存活病人中有一半會在5年內失去對側肢體【4】。據估計目前成年糖尿病患者數量為4.15億，至2040年會增加至6.42億，開發預防和治療慢性傷口及其感染的方法將會持續成為降低醫療成本和改善全球公眾健康的重中之重【5】。
與不斷增加的慢性傷口患病率相對應的，是目前傷口治療水平的不足，常常會因為對感染背後的微生物學的不理解、不懂得如何控制和清除感染而導致截肢。感染會使傷口情況複雜化和延遲癒合過程，近來的研究表明微生物生物膜的存在，相比於浮游細菌，對於慢性傷口的發生和發展起著更顯著的作用。超過90%的慢性傷口有生物膜的感染，而急性傷口中僅有6%有生物膜【6】。生物膜的自我保護能力和毒性似的完全從慢性感染的傷口床將其清除變得極其困難。
這些發現導致了一些列有趣的問題。為什麼生物膜會出現在慢性傷口？是否是慢性傷口的環境促進了生物膜的形成，還是生物膜的出現使得傷口變成了慢性傷口？目前針對與生物膜相關的慢性傷口的治療方法有哪些？生物膜有哪些特點和特性使其能躲過各種治療方法？對於慢性傷口的治療，還有哪些方法可以嘗試？
生物膜的一般背景
Figure 2. 綠膿桿菌生物膜生命週期。來源: Hauser et al. 2011. Nature Reviews Microbiology 9(3): 145.
自然界中大部分細菌都可以集聚形成三維、多細胞的社群，緊緊附著在基底層或物質表面，這些微生物社群即為生物膜。當自由遊動、浮游細菌發現富有營養物質的適合環境時，它們就會形成生物膜固著在該環境中。生物膜的生命週期包含4個階段（Figure 2）。首先細菌細胞附著在表面、形成很多微菌落，然後向周圍分泌多聚糖或糖蛋白，以便更多的細菌可以吸附。隨著越來越多的細菌集聚在一起，化學信號的濃度達到了某種閾值，刺激菌落細胞發生基因變化，使得細菌細胞更牢固地附著在表面和與周圍細菌更緊密的結合。菌落產生很厚的細胞外基質，由胞外多聚糖（EPS）、蛋白質、細胞外DNA（eDNA）和其他聚合物構成，在細菌周圍形成了保護性的物理屏障，終使長成成熟的生物膜，在這種複雜的細菌社群中，個體間可以通過化學信號進行溝通，即群體效應（Quorum sensing, QS）。QS系統能夠讓細菌通過分泌和接受化學信號來感受其他細菌的存在。一旦生物膜達到了一定的細胞密度水平，即飽和度，生物膜即會關閉表達EPS的基因，重新激活鞭毛運動基因，得以向周圍環境播散浮游細菌，去尋找新的適宜環境【8】。以綠膿桿菌為例，其生產的EPS包含藻酸鹽、Pel和Psl【9】。當生物膜菌落的營養物質或氧氣消耗殆盡時，綠膿桿菌就會分泌藻酸鹽裂解酶，以溶解周圍的EPS，為細菌播散做好準備。
Figure 3. 葡萄球菌（左）、大腸桿菌（中）在尿管上形成的生物膜的掃描電鏡下圖像。生物膜形成複雜的晶體狀結構（右）。來源: Kumar et al. 2013. JAPI 61.
切記雖然一些生物膜可能主要由單一種類微生物構成，大部分生物膜含有多種微生物。生物膜的多樣性越高，這種多重微生物社群更能發展出有益的協同關係以獲得更大的存活機會。
為什麼生物膜經常發生在慢性傷口，而少見於急性傷口呢？是慢性傷口的環境促進了生物膜的形成，或是生物膜的存在造成了傷口的“慢性化”？研究顯示答案是兩者兼有。慢性傷口的環境非常適合機會致病菌形成生物膜，而生物膜的固有特性能造成傷口癒合停滯在炎症期，使得感染遷延不愈。
生物膜延遲傷口癒合的機制
生物膜的三個主要特性造成了傷口感染的慢性化。首先，生物膜的微生物多樣性使得發現適合的和最有效的治療方法變得頗具挑戰，因為在生物膜和周圍耐藥菌群的保護下，平時非致病的微生物也獲得了抗生素耐藥性。其次，生物膜細胞外EPS基質的結構和構成作為屏障阻止免疫細胞和抗生素的侵犯，同時通過群體感應中的化學信號溝通和DNA分享機制促進對清創（機械清除）和抗生素抵抗力的快速形成。最後，生物膜長久和持續存在造成了免疫系統的過度刺激，而後者則為細菌提供了進一步生長的養分。
#1 多重微生物生物膜中的致病協同
Figure 4. 傷口中微生物感染進展過程和生物膜形成過程具有一致性。來源: Wounds, 2004, Health Management Publications, Inc.
生物膜微生物多樣性的構成似乎要經歷一個隨時間發展的模式，而這一發展模式與生物膜的形成過程相匹配（Figure 4）【13】。在傷口汙染的最初階段，在傷口變成慢性之前，正常皮膚菌群佔主導，大部分為需氧的革蘭氏陽性細菌。此時，生物膜不具有致病性，而被激活的宿主免疫系統可以使傷口在數週內癒合。然而，兼性厭氧革蘭氏陰性菌開始侵入傷口，利用需氧菌消耗氧氣而為其在傷口床創造的生存空間。在微生物和宿主免疫細胞間的平衡被打破，傷口到達“嚴重定植”狀態。隨著傷口進一步惡化，影響深層組織如肌肉和骨骼，更多的厭氧菌得以在低氧的傷口環境中生存。
Figure 5. 慢性傷口與急性傷口的菌譜對比。慢性傷口具有更大的細菌多樣性。來源: Tuttle et al. 2011. Journal of Clinical Microbiology 49(11): 3812-3819.
生物膜的微生物多樣性越大，基因庫就越大，細菌間會有更多機會建立互惠互利的互助關係。
#2 EPS基質：抗生素屏障
形成生物膜後的細菌的抗生素耐藥性比浮游細菌高500至5000倍，包括那些在正常情況下對抗生素敏感的菌種【7】。生物膜的形成如何使耐藥性的提高成為可能？可能的機制有幾種。
首先，生物膜中的細菌由於對生物膜環境中的營養物質和空間進行競爭而生長增殖放緩和代謝率下降；其次，EPS基質中的蛋白質和多糖成分能夠妨礙和延緩抗生素穿透生物膜，從而給予位於基質深部的成熟細胞更多的時間發展耐藥性；第三，一些細菌本身具有耐藥性和產生抗生素耐藥因子，從而增強整個生物膜社群的耐藥性；這被稱為被動耐藥。
#3 橫向基因轉移誘導的抗生素耐藥
Figure 6. 生物膜中包含接合型F質粒大腸桿菌間的聯繫。來源: May, 2008. Journal of Bacteriology 190: 7479-7490.
細菌間可以通過橫向基因轉移來分享抗生素耐藥基因，這是不同菌株間交換基因的一種機制。生物膜中最常見的橫向基因轉移方式是轉化和接合。
#4 群體感應：抵抗宿主免疫防禦
或許一個最重要但最不為了解的生物膜細菌耐藥機制是化學信號通訊（Chemical signaling）和群體感應（Quorum Sensing, QS）。QS調節生物膜發展和毒性因子的生產，增加對宿主免疫防禦的抵抗力，允許狹小空間裡容納高密度細胞的生物膜基質結構能增強其效率。
研究發現QS是傷口“慢性化”的關鍵決定因素。綠膿桿菌有三個QS系統，以一種複雜、分層的方式結合在一起，其中有三個關鍵的QS信號分子，即3-oxo-C12-homoserine lactone, C4-homoserine lactone, 和假單胞桿菌喹諾酮類信號（PQS），分別由Lasl, Rhl和Pqs系統控制（Figure 7）【22】。
Figure 7. 綠膿桿菌利用三種群體感應系統的複雜配合來調控生物膜基質和一些毒性因子的生產。來源: Hauser et al. 2011. Nature Reviews Microbiology 9(3): 145.
細菌生物膜的QS系統不僅僅能造成宿主免疫細胞的溶解。宿主自身的防禦系統在傷口癒合的炎症期可以延遲癒合過程。在正常或急性傷口的癒合過程中，傷口中MMPs和TIMPs的水平處於平衡狀態；但在慢性傷口中，平衡被破壞。慢性傷口感染使得MMPs的表達水平增高，而TIMPs的水平下降，進而減少了傷口修復所需要的生長因子的水平【26】。
結論
目前治療生物膜相關慢性傷口的方法有很多，但科學家和醫務人員還沒有發現最有效和效率最高額治療方法組合。目前的治療方法主要有三大類：機械清創、抗生素和抗生物膜/生物膜破壞製劑如QS阻斷劑。三類中單靠任何一種都無法提供足夠的治療效果。機械清創，如手術，常常無法完全去除生物膜，因為EPS基質會深入深部組織結構。任何殘留都會使生物膜很快恢復。此外，清創需要持續進行，對於不規律清創的傷口僅有25%能癒合，而每週清創的傷口83%能癒合【6】。單獨使用抗生素治療也不足夠，因為生物膜具有很多耐藥機制（如前文所述）。將抗生素與機械清創聯合使用展現出了一些好的結果，但關鍵是要在生物膜形成的早期使用，越早，效果越好。研究顯示新形成的生物膜相比與成熟階段對抗生素更敏感。生物膜形成細菌金葡菌和綠膿桿菌在清創後48小時內對抗生素的敏感性更高，但在此期間的後半段（24-48小時）已經開始形成耐藥（100%對漂白劑和慶大黴素耐藥），72小時後，綠膿桿菌恢復至清創前的耐藥性【27】。該組合方法目前仍具有一些侷限性。如前所述，通過清創完全清除生物膜是不可能的，而持續使用抗生素治療殘留細菌（可能是年老、成熟的生物膜）會使其發展出抗生素耐藥性。
很多研究人員正在研發抗生物膜（Antibiofilm）製劑以代替抗生素來治療生物膜。抗生素製劑不是抗生素，但可以影響生物膜的發展，其機制包括阻斷QS系統、降解EPS基質、或阻斷浮游菌的附著。Furanone是一種抗生物膜製劑，是一種QS阻斷劑，它可以干擾化學信號分子乙酰高絲氨酸內酯（Acyl homoserine lactone, AHL），而AHL對於生物膜社群抗生素耐藥性的增加發揮作用。當使用Furanone和妥布黴素治療綠膿桿菌時，QS系統的關閉造成細菌對抗生素敏感性的增加（Figure 8）。QS阻斷劑本身不能直接削弱或殺死細菌，但其可以增加細菌對妥布黴素的敏感性【8】。因此，QS阻斷劑比須與抗生素配合使用以避免細菌產生對阻斷劑的耐受性。
為了讓這些治療方法獲得最大效果，須儘早確定生物膜的菌譜特點。標準培養方法需要數天才能獲得結果，而且常常無法探測到一些需要特別生長環境的細菌如厭氧菌，而厭氧菌構成了慢性傷口生物膜的大部分【12】。鑑於生物膜發展的速度和給我們的治療窗口期很短，我們需要使用分子診斷的方法來確定其構成。研究建議應用PCR和測序來識別細菌種類和量化其在生物膜中的比例。另一種被推薦和常用的診斷工具是“Bar coding”，使用慢性傷口液體或組織活檢來識別慢性標記物，例如生長因子及其受體或MMPs。生長因子是一種實用的標記物，因為其對於啟動傷口癒合至關重要，其水平的下降是傷口慢性化的強有力的指針【15】。
對於所有這些診斷和治療方法來說，必要的前提是更好的瞭解和區分有害細菌和有益傷口癒合的細菌。Tuttle等對慢性傷口微生物構成的研究顯示綠膿桿菌，儘管其眾所周知的致病性，是能在6個月內癒合傷口中的主要菌種，而6個月內未癒合的傷口的主導菌種為放線菌【12】。這些結果或許表明綠膿桿菌可能可以阻止其他致病性更高的菌種在傷口定植，或多或少“保護”宿主，防止發生慢性傷口感染。研究應該將重點放在對生物膜中致病菌和“有益”菌的特點描述上，尋找能在早期分子診斷結果後使用的清創與生物膜破壞和/或抗生素治療的最有效結合方法。
原文作者：Katie Kaestne
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