李思妮, 王鑫, 白樺, 王潔. 腫瘤突變負荷對非小細胞肺癌免疫治療效果的預測價值[J]. 中國醫學前沿雜誌（電子版）, 2019, 11(12): 18-23.

作者單位：

李思妮，王鑫，白樺，王潔（國家癌症中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院 腫瘤內科，北京 100021）

【摘要】 肺癌的高發病率和高致死率均位居全球癌種前列，這已成為當今世界健康領域迫切需要解決的問題。不同於針對腫瘤細胞的傳統化療、放療和靶向治療，近年來針對全身免疫系統的免疫檢查點抑制劑治療逐漸走進人們的視野，這種新型的治療模式在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的治療中取得了突破性進展。然而免疫治療的獲益人群有限，因此需要藉助有效的生物標誌物來篩選出獲益人群。大量臨床研究表明腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）是一種潛在的獨立生物標誌物，可預測NSCLC免疫治療效果，本文將對TMB和基於TMB的NSCLC免疫治療效果的預測價值和最新臨床研究進展進行綜述。

【關鍵詞】 非小細胞肺癌；免疫治療；免疫檢查點抑制劑；腫瘤突變負荷

惡性腫瘤已成為我國居民健康的重要殺手，其中肺癌是造成人類死亡的最常見癌種，且高居榜首。肺癌分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中NSCLC佔肺癌的85%以上[1]。大量研究表明，驅動基因陽性晚期NSCLC患者能從小分子受體酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）治療中明顯獲益，且隨著肺癌一系列致癌驅動基因的確定，肺癌的分型逐漸細化為基於驅動基因的分子亞型，故驅動基因陽性晚期NSCLC的治療也更為精準[2]，但患者最終會對靶向藥物產生耐藥，因此需要替代治療方案來改善晚期NSCLC患者的預後[3]。長期以來，基於鉑類的標準化療一直是驅動基因陰性晚期NSCLC患者的主流一線治療，但效果有限。近年來隨著免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）如抗程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）和抗程序性死亡蛋白配體-1（programmed death-ligand-1，PD-L1）抗體的發展，極大地改變了驅動基因陰性晚期NSCLC的治療前景[4]。

儘管免疫治療取得了突破性進展，但仍有約80%未選擇的NSCLC患者對PD-1或PD-L1抑制劑無應答。因此，為了更好地篩選獲益人群，確定能夠預測ICIs療效的最佳生物標誌物至關重要[5-7]。通過免疫組化（immunohistochemistry，IHC）檢測到在腫瘤細胞上表達的PD-L1已作為一種生物標誌物用於篩選NSCLC免疫治療獲益人群，並被FDA批准作為伴隨診斷測試（companion diagnostic test，CDx），然而使用PD-L1作為生物標誌物仍然有一定侷限性[8]，故迫切需要探尋更可靠的生物標誌物[7-9]。近年來，腫瘤突變負荷（tumor mut­a­tion burden，TMB）成為研究熱點，它是一種具有廣闊前景的、獨立的預測生物標誌物，有望為腫瘤免疫治療進入精準醫療時代開闢道路[10]。本文討論了TMB及其對晚期NSCLC患者ICIs治療效果的預測價值以及當前進展和挑戰，旨在為未來的研究提供一些思路。

1 非小細胞肺癌患者的免疫檢查點抑制劑治療

ICIs通過與抑制性的共受體結合阻斷抑制信號，從而增強T細胞活化和增殖，發揮抗腫瘤作用，目前研究最多的當屬抗PD-1、抗PD-L1和抗細胞毒T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）抗體[11]。1期CA209-003研究顯示，Nivolumab用於治療既往接受過多線治療的晚期NSCLC，患者5年生存率高達15.6%[12]。3期KEYNOTE-024研究也顯示與化療相比，Pembro­li­z­­umab一線治療PD-L1高表達的晚期NSCLC能顯著延長患者的總生存期（overall survival，OS）和無進展生存期（progress free survive，PFS），且不良反應較輕[13]。隨後的KEYNOTE-189研究進一步顯示，與單純化療相比，在初治、無表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）或ALK突變的轉移性非鱗狀NSCLC患者中，Pembroli­zu­mab聯合培美曲塞和鉑類的標準化療顯示出更長的PFS和OS[14]。另51%～87%的NSCLC患者表達CTLA-4，針對這一途徑的ICIs正在研究中[15]。最近一項大規模的薈萃分析也顯示，與常規治療相比，ICIs治療能顯著延長NSCLC患者的OS與PFS[16]。

越來越多的研究顯示ICIs治療已經在生存率、疾病管理、耐受性和替代化療方面取得了巨大的進步，目前Nivolumab、Pembrolizumab和Atezoliz­umab已被FDA批准用於經治的NSCLC患者，Pembro­lizu­mab也獲批用於PD-L1表達＞50%的NSCLC患者的一線治療。此外，Durvalumab也被批准作為同步放化療後的鞏固治療用於PD-L1陽性的Ⅲ期NSCLC患者[15,17]。當前各種組合治療的臨床試驗正在如火如荼地進行，以幫助確定晚期NSCLC的最佳治療方案，實現個體化精準治療。

2 何為腫瘤突變負荷?

在瞭解TMB之前，我們首先應瞭解生物標誌物的概念。生物標誌物的特徵在於能客觀測量和評估，是一種能夠體現正常生理過程、病理過程或治療干預後藥理學反應的指標，可用於預測患者對特定治療的療效並評估預後[18]。目前候選的預測生物標誌物包括腫瘤抗原[TMB、微衛星不穩定性（microsatellite inst­ab­i­lity，MSI）、新抗原等]、炎性細胞[腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）、基因標誌物、表達PD-L1蛋白的腫瘤相關免疫細胞等]、腫瘤免疫抑制細胞或蛋白（PD-L1、CTLA-4、調節性T細胞、骨髓來源的抑制性細胞、吲哚胺-2,3-雙加氧酶、淋巴細胞活化基因3等）和宿主因子（微生物、單核苷酸多態性等）[19]。

TMB是近年來受到廣泛關注的一種明星生物標誌物，被定義為基因編碼區域內每兆鹼基體細胞非同義突變的總數，包括小插入缺失變異體[19]。由於長期接觸菸草煙霧，NSCLC患者表現出更高的突變率[20]，在大樣本人群中的全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）結果也表明，對抗PD-1/PD-L1抗體產生反應的腫瘤組織（包括NSCLC），具有很高的體細胞突變數量[21]。TMB值在不同腫瘤類型中有很大的變異性，在NSCLC中尤為廣泛[20]，且其在同一腫瘤內也存在差異，如在攜帶EGFR、ALK、ROS基因突變的肺癌中，體細胞突變常顯著減少，而KRAS或BRAF基因改變似乎並不影響肺癌組織中細胞突變[3]。

由於腫瘤細胞的非同義突變可導致新抗原的產生，腫瘤特異性新抗原的存在又與腫瘤免疫原性增加有關，機體的免疫系統識別大量的新抗原後能增強T細胞對腫瘤的活性，從而增強ICIs的療效[7]。故TMB也是一種間接測量腫瘤新抗原的方法。Albor­elli等[22]也提到，若腫瘤呈現更高的TMB、更多的新抗原，則該腫瘤可能對免疫治療有更好的反應。Rizvi等[20]的研究驗證了上述假設，該研究通過對接受Pembr­o­lizu­mab治療的兩組NSCLC患者的外顯子及其匹配的正常DNA進行測序，發現腫瘤中較高的TMB與患者的客觀有效率（objective response rate，ORR）改善、PFS延長密切相關。另有研究表明高TMB與吸菸史[23]、MSI、DNA聚合酶、APOBEC等基因突變有關[9,24]。

3 腫瘤突變負荷可預測非小細胞肺癌患者免疫檢查點抑制劑治療效果

2014年Snyder等[25]通過使用全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）來鑑定與CTLA-4阻斷相關的遺傳基礎，發現高TMB與免疫治療效果有關，但研究者也指出僅依靠TMB不足以預測療

效。隨後在CheckMate-026臨床研究中，研究者將Nivolumab和基於鉑類的化療分別用於晚期NSCLC的一線治療，同時用WES測量TMB，並將患者分為三組（＜100 mut/Mb、100～242 mut/Mb、≥243 mut/Mb），結果顯示，與化療組相比，高TMB亞組（≥243 mut/Mb）患者使用Nivolumab治療後有更長的PFS和更高的ORR[17]。

Ⅱ期CheckMate-568研究和Ⅲ期CheckMate-227研究結果也顯示Nivolumab聯合低劑量Ipilimumab作為晚期或轉移性NSCLC的一線治療是有效且可耐受的，無論PD-L1表達水平如何，使用Nivolumab聯合低劑量Ipilimumab一線治療的TMB≥10 mut/Mb的晚期NSCLC患者的PFS顯著長於化療組患者，ORR也更高，因此，TMB≥10 mut/Mb被認為是篩選免疫治療獲益人群的一個有效的cut-off值[26,27]。這兩項研究均證實了Nivolumab聯合Ipilimumab在晚期NSCLC患者中的治療優勢，以及TMB作為生物標誌物預測晚期NSCLC患者免疫治療效果的價值。基於這些臨床研究，2018年10月，美國綜合癌症網絡（National Comprehensive Cancer Network）指南發佈了非小細胞肺癌指南2019年第1版，TMB正式被列入其中，該指南也指出儘管TMB有助於篩選獲益人群、預測免疫治療效果，但其作為一種生物標誌物尚處於研究階段，對於如何測量TMB水平，目前仍未達成共識，仍是亟待解決的問題，需要後續進一步研究。

4 腫瘤突變負荷預測非小細胞肺癌免疫檢查點抑制劑治療效果的研究進展

由於高達30%的NSCLC患者沒有足夠的組織用於檢測生物標誌物，因此迫切需要探究新方法以確定哪些患者更有可能受益於免疫治療。Gandara及其同事通過對POPLAR、OAK兩項研究進行回顧性分析，評估了一種新的、基於外周血中循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的TMB（bTMB）檢測方法，其中POPLAR研究為訓練集，OAK研究為驗證集。研究者首先使用兩項研究中患者的組織和血漿樣本進行了tTMB和bTMB的一致性分析，結果顯示同一患者的tTMB與bTMB呈正相關（Spearman秩相關係數為0.64），證實了bTMB的分析效能。在POPLAR訓練集中發現，當bTMB≥16時，Atezo­lizu­mab組患者的PFS和OS顯著長於多西他賽組，故研究者選用bTMB≥16作為cut-off值，隨後在OAK研究中進行驗證，也得出相似結果。該研究指出，使用bTMB≥16的cut-off值可重複識別從Atezoli­z­umab獲益最大的患者[17,28]。這項研究第一次證實了可在血漿ctDNA中準確、重複測量TMB，且高bTMB與ICIs治療效果相關[28,29]。

2019年美國癌症研究協會（American Assoc­ia­tion for Cancer Research，AACR）年會報道了另一項Atezolizumab研究進展，B-F1RST研究是第一項評估bTMB作為預測Atezolizumab一線治療NSCLC效果的前瞻性研究，該研究將bTMB≥16作為cut-off值，對患者進行分組（bTMB≥16、bTMB＜16），在生物標誌物可評估患者[最大體細胞等位基因頻率（maximum somatic allele frequency，MSAF）用於評估樣品中ctDNA水平）≥1%]中，研究者發現高bTMB組較低bTMB組患者對Atezoli­z­u­mab有更高的ORR（28.6%∶4.4%），但在生物標誌物不可評估患者（MSAF＜1%）中，也發現有較高的ORR（34.5%），這些患者由於ctDNA水平較低（MSAF＜1%）而無法評估bTMB。基於此結果，研究者進一步對比了MSAF≥1%和MSAF＜1% 2個亞組的臨床結局，結果顯示，與MSAF≥1%的患者相比，MSAF＜1%的患者基線具有更好的預後因素，而校正基線差異後，2個亞組ORR和中位PFS比較差異均無統計學意義，但這些結果並不會影響高bTMB對MSAF≥1%患者ORR的預測價值。目前bTMB試驗的臨床驗證在B-F1RST和BFAST研究中繼續進行，值得後續追蹤。

大部分TMB的評估均通過二代測序（next-generation sequencing，NGS）來完成，NGS方法包括WGS、WES和NGS-Panel。由於WGS和WES分別對整個基因組、全外顯子組進行測序，這兩種方法昂貴且耗時，而NGS-Panel則集中於癌症相關基因，並與算法相結合，能快速報告癌症相關基因的改變[30]，其檢測TMB的準確性與WES有很好的相關性[9,31]，但Panel的大小必須滿足特定的要求，以保證檢測TMB的精確性[32]。目前FDA已批准Foundati­onOne CDx和MSK-IMPAKT Panel用於臨床試驗[8,33]。通過NGS-Panel測定的TMB與WES測定的TMB之間的相關性，可以瞭解需要覆蓋的最佳基因數量，從而正確推斷TMB[3]。Wang等[34]利用癌症和腫瘤基因圖譜的WES數據開發並驗證了用於TMB評估的一種新型的癌症基因Panel（CGP），又稱NCC-GP150。該Panel包括150個選定的癌症相關基因的整個外顯子區域。將NCC-GP150檢測的TMB與FDA批准的CGPs的TMB進行對比，發現TMB估測性能相當。在Rizvi等的NSCLC隊列研究中完成虛擬驗證後，研究者納入48例具有腫瘤組織和血漿樣本的NSCLC患者進行技術驗證，結果顯示，NCC-GP150 Panel估測的bTMB與WES估測的tTMB之間具有較好的相關性（Spearman秩相關係數為0.62），當NCC-GP150估測的bTMB≥6時，約登指數為最佳，敏感度和特異度分別為0.88和0.71。隨後研究者又進行了臨床驗證，證實了NCC-GP150 Panel的臨床可行性，在50例使用抗PD-1或抗PD-L1抗體治療的晚期NSCLC患者中，bTMB≥6的患者ORR高於bTMB＜6的患者（39.3%∶9.1%），PFS也顯著延長。該研究也顯示bTMB和PD-L1水平無相關性，這與既往tTMB的研究一致[34,35]。該研究系統地探討了用於bTMB估計的靶向基因Panel的最佳大小和算法，證實了經NCC-GP150檢測的基於ctDNA的bTMB可作為抗PD-1和抗PD-L1治療NSCLC的潛在預測生物標誌物。

另一項研究也證實了WES檢測的TMB與NGS-Panel檢測的TMB可用於預測NSCLC ICIs療效，且這兩種檢測方法具有很好的相關性（Spearman秩相關係數為0.81）。值得注意的是，該研究中使用的大Panel基於中國人群。通過WES和大Panel對78例接受抗PD-1或PD-L1治療的NSCLC患者進行全面的基因組分析，研究結果首次證實了TMB在中國肺癌患者中的預測價值同樣有效，也證實了這一來自中國公司的Panel也能準確地檢測TMB。此外，研究者還發現了攜帶FAT1基因突變且TMB高的患者從免疫治療中獲益更大，這也表明將TMB和其他潛在生物標誌物結合，可能會提高對NSCLC患者ICIs治療效果的預測能力[36]。

由於免疫治療聯合其他常規治療極大地改善了晚期NSCLC患者的生存，為了進一步篩選獲益人群，研究者迫切希望找到預測聯合治療效果的生物標誌物，且研究表明TMB對PD-1聯合CTLA-4阻斷治療NSCLC的療效具有較強的預測作用[37]，那麼TMB是否會影響ICIs聯合化療的NSCLC患者的療效呢？第20屆世界肺癌大會（World Conference on Lung Cancer，WCLC）給出了答案，會議報道了兩項關於TMB研究的最新進展，其中，KEYNOTE-021研究通過腫瘤的WES和匹配的正常DNA確定tTMB，結果顯示tTMB作為連續變量與Pembroli­z­umab聯合化療或單純化療一線治療非鱗狀NSCLC的ORR、PFS和OS均無明顯相關性，tTMB與PD-L1表達也無明顯相關性，在接受Pembrolizumab聯合化療治療的患者中，tTMB與組織多態特異性抗原之間無顯著相關性，且無論tTMB如何，均有較高的ORR；KEYNOTE-189研究結果同樣顯示tTMB與Pembro­l­izumab聯合化療一線治療非鱗狀NSCLC的療效無相關性。上述兩項研究均證實了TMB對Pembrol­izumab聯合化療的療效無預測價值，故TMB仍是值得探索的難題，任重而道遠！

5 腫瘤突變負荷在臨床應用中的侷限性和展望

儘管TMB已作為獨立預測指標用於預測NSCLC患者ICIs治療效果，但其仍存在許多侷限性，如各研究結果的cut-off值不明確，雖有研究證明TMB對ICIs聯合ICIs治療NSCLC具有預測作用[33]，但現有研究也證實TMB對ICIs聯合化療治療NSCLC無預測價值，且TMB檢測沒有標準化[4]。另一方面，組織標本的質量和數量、腫瘤組織異質性、不同的檢測平臺、相對較長的檢測時間、昂貴的價格等均限制了tTMB的應用[10]。ctDNA在患者血漿中的檢測率仍不高，且目前用於確定bTMB的Panel，均使用不同的基因、序列和cut-off值，導致研究結果缺乏協調性[38]。此外，TMB不能代表免疫原性的直接證據，也不能準確預測動態免疫反應。

當TMB與PD-L1相結合，可產生對ICIs療效相加或協同的預測作用[4]，且在腫瘤細胞上無PD-L1表達或TMB低的患者中也可觀察到ICIs的療效[33]，故為了更準確地篩選獲益人群，需要在未來創建一個預測生物標誌物的系統，將TMB和其他與ICIs療效有關的參數（如PD-L1、TILs、MSI、微生物等）相結合，以便進行精準預測[9,24,33]。也需要努力提高ctDNA的檢出率，實現檢測技術的均一化，並開展臨床試驗，前瞻性地評估bTMB對肺癌患者ICIs治療效果的預測價值[38]。由於tTMB是一個連續的變量，故明確用於免疫治療效果預測的cut-off值尤為重要[39]。

免疫治療是腫瘤治療的重要轉折點，為腫瘤患者帶來了福音。然而，並非所有患者均能從中獲益，故急需探索高效預測免疫治療效果的生物標誌物。TMB已被證明是一種潛在有效且獨立的可預測NSCLC患者ICIs治療效果的生物標誌物，已逐漸從臨床研究走向臨床應用，但其仍存在許多侷限性，僅根據TMB對患者進行分類尚不能準確預測生存情況，故整合腫瘤基因和免疫微環境相關因子的生物標誌物體系是未來研究的重點，需要建立多個生物標誌物的綜合評估模型，以指導個體化精準治療。

參考文獻（略）

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