人TERT基因啟動子突變檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
【產品名稱】人TERT基因啟動子突變檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
【包裝規格】20人份/盒、50人份/盒
【預期用途】
本試劑盒用於定性檢測確診為腦膠質瘤患者的病理組織切片中人類基因組DNA的TERT基因啟動子區域2種突變C228T（chr5:1,295,228C>T）和C250T（chr5:1,295,250C>T），結合IDH基因突變情況，為醫生對腦膠質瘤患者病理分型提供參考。
端粒逆轉錄酶（TERT）是一個癌症相關基因，負責編碼端粒酶元件。端粒酶具有幫助保護染色體兩端，維持細胞壽命的功能。已有多項研究證實TERT基因啟動子序列突變與多種腫瘤有關，突變導致TERT啟動子區域出現了一些特異性轉錄因子的新結合位點，致使轉錄活性增高，從而提高TERT基因的表達，造成癌細胞無限增殖的特性。
大量研究發現在膠質瘤中存在TERT基因啟動子區的特徵性突變，C228T和C250T，突變率約55%，主要集中於原發性膠質母細胞瘤和少突膠質細胞瘤中。發生突變的腫瘤中TERT的表達量是野生型樣本的6.1倍。根據是否突變，結合IDH的突變情況，能夠對膠質瘤進行分子分型，及對預後進行評估。
【檢驗原理】
本試劑盒採用PCR-熒光探針法，針對TERT基因啟動子區突變位點C228T和C250T分別設計特異性引物，探針與PCR MasterMIX等製備成反應液。待檢樣本中含有突變DNA模板時，對應檢測反應體系中的突變位點特異性引物、探針與模板DNA結合，PCR擴增得以進行並釋放熒光信號，待檢樣本中不含突變DNA模板時，反應體系中的突變位點特異性引物、探針不與模板DNA結合或與模板的結合受阻，無PCR擴增或PCR擴增受到抑制，無熒光信號的釋放。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中的熒光信號強度進行實時檢測和輸出，實現檢測結果的定性分析。
【主要組成成分】
1、 產品中包含的試劑組分及規格：
試劑名稱
規格（20人份/盒）
規格（50人份/盒）
注意： 1. 試劑盒不同批次的組分不能互換使用。
2. 試劑盒中中的所有組分及樣本，均應視為具有潛在的危險性，避免直接用皮膚直接接觸。
2、試劑盒沒有提供的其它必需品：
2.1、基因組DNA提取試劑盒：待檢樣本基因組DNA提取
2.2、紫外分光光度計：待檢樣本基因組DNA質量檢測
2.3、其它的一些設備或材料：實時熒光定量PCR儀、離心機、移液器、移液吸頭、定量PCR反應管（96孔板或8聯管）
【儲存條件及有效期】
儲存條件：-20℃ 保存，避免冷藏。打開包裝後，使用完後需繼續放在-20℃ 保存，反覆凍融次數不超過5次。建議開封並反覆凍融的試劑盒儘快的使用完。
有效期：12個月。
【適用儀器】
本產品最適設備為ABI 7500實時熒光定量PCR儀, 其它設備Agilent Mx3000p/3005, Roche LightCycler 480/cobas z 480, QIAGEN Rotor-Gene Q, Bio-Rad CFX96，宏石，博日等也能夠使用，需要具體驗證。
【樣本要求】
1、本試劑盒適用於從病理組織中（包括新鮮組織、石蠟包埋組織和石蠟組織切片）提取的人類基因組DNA的檢測，應由醫生確認含有腫瘤組織。
2、待測樣本中提取到的DNA需用紫外分光光度計測定濃度和純度，要求DNA的A260/A280在1.8-2.0之間，並根據測定的濃度講DNA稀釋至30-50ng/μl。提取的DNA建議立即進行檢測，否則應在-20℃以下保存，保存期間避免反覆凍融。
【檢驗方法】
一、實驗步驟
1、 試劑準備
1.1 取出試劑盒，室溫放置至少1小時，平衡至室溫。
1.2 算當次實驗所需要的反應數（n）
n=樣本數*3
按照下表配製反應混合液。按照17μl/孔分裝量將配製好PCR反應混合液分裝至PCR反應管或96孔板中，離心機瞬離10秒。
表：反應混合液體系
組分名稱
加量μl/孔
PCR MasterMIX
10μl
RNase-free H2O
7μl
1.3 PCR反應管轉移至樣本準備區。剩餘試劑放回-20℃±5℃冰箱冷凍避光保存。
2、 樣本準備：
2.1 核酸抽提：根據推薦基因組DNA提取試劑盒對樣本進行DNA提取。
2.2 用紫外分光光度計進行檢測，計算濃度和純度。並做好標記。
2.3 將待測樣本DNA依次取2μl加入已分裝PCR反應液的反應管中，離心機瞬離10秒。
2.4 將TERT引物依次取1μl分別加入已混合PCR反應液（17μl）和樣本（2μl）的反應管中，離心機瞬離10秒。即每個待測樣本分別用TERT的3種引物進行檢測。
2.5封膜或加蓋。封膜時，手只能接觸邊緣部位，不能直接與封膜或管蓋的光吸收處接觸，膜與96孔之間不能有縫隙和氣泡。
2.6 若PCR反應管內加入模板後遇臨時情況不能立即上機，建議將加好模板的PCR反應管放於2~8℃條件暫時保存，並在24小時內儘快上機檢測。
2.7 PCR反應管轉移至樣本準備區。剩餘試劑放回-20℃±5℃冰箱冷凍避光保存。
3、PCR擴增：（核酸擴增區）
3.1開機，並進行儀器性能自檢。
3.2取樣本準備區準備好的PCR反應管，放置在儀器樣本槽相應位置，並記錄放置順序。
3.3按表：儀器擴增相關參數設置，並開始進行PCR擴增。反應結束後，根據擴增曲線，劃定合適熒光閾值（一般將閾值劃定在擴增曲線對數形式下指數增長期的中間），得到不同通道Ct值並計算相關△Ct值。
表3：儀器擴增相關參數
體系
總體積為20μl
信號採集
均為FAM通道採集熒光信號。
PCR反應條件
階段
條件
循環數
預變性
95℃：15分鐘（min）
1
PCR
95℃：15秒（s）
45
60℃：30秒（s）
（設置在此階段結束時採集熒光信號）
融解曲線
95℃：15秒（s）
1
60℃：1分（min）（設置在此階段到下階段時採集熒光信號）
1
95℃：15秒（s）
1
降溫
25℃：15秒（s）
1
3.4數據處理：反應結束後，根據擴增曲線劃定閾值，計算△Ct值（△Ct值=Ct（C228T或C250T）-Ct（C228/250T-W）），並進行結果判讀。
二、結果計算與結果判定：
記錄下每個反應的Ct值，根據下表進行判讀：
突變類型
陽性
陰性
C228T
Ct（C228T-M）≤45，且Ct（C228/250T-W）≤30
Ct（C228T-M）無Ct值，且Ct（C228/250T-W）≤30
C250T
Ct（C250T-M）≤45，且Ct（C228/250T-W）≤30
Ct（C250T-M）無Ct值，且Ct（C228/250T-W）≤30
【檢驗結果的解釋】
1、 樣本檢測時，需要進行DNA抽提，DNA抽提質量的好壞，直接影響最終的檢測結果。
2、 檢測結果完全一致，醫生需要根據病人的個體差異進行區別對待，給出不同的建議。
【檢驗方法的侷限性】
1、本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，應結合其症狀/體徵、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。
2、樣本中核酸過度降解或擴增反應體系中靶基因濃度低於檢測限亦可造成假陰性結果。
3、不合理的樣本採集、轉運及處理，以及不當的試驗操作和實驗環境均有可能導致假陰性或假陽性結果。4、明確該檢測僅限於規定的樣本類型及檢測系統（包括適用機型、核酸分離/純化試劑、檢測方法等）。
5、本檢測試劑的檢測範圍僅包括檢測試劑聲稱的基因範圍，不包括檢測試劑盒聲明之外的基因的檢測。
【產品的性能指標】
1、試劑盒包裝完整，無內容物溢出；標籤外觀完整，無脫落，標籤標識內容清晰；試劑盒內組成正確，無重複、缺失組分的情況。
2、用3份陽性參考品進行檢測，其檢測結果應為陽性，100%符合。
3、用5份陰性參考品進行檢測，其檢測結果均應為陰性，100%符合。
4、試劑盒檢測限可達到：1ng樣本中能準確檢測出對應基因型。
5、使用試劑盒重複檢測精密度參考品10次，應檢出對應基因型，且檢測結果Ct值變異係數CV≤5%。
【注意事項】
1、因產品檢測樣本為人的組織，存在著潛在的生物安全，所以檢測時應小心防護，防止其它潛在感染性。
2、本試劑盒為PCR試劑盒，臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規範執行。
3、標本的處理和檢測標本的容器、檢驗過程中使用的材料的處理要符合《醫療廢物管理條例》和《醫療衛生機構醫療廢物管理辦法》，以及國家、地區的相關要求。
4、在使用過程當中，應注意各個原料之間的錯用及交叉汙染。
5、使用試劑過程當中，應嚴格按照儀器和試劑說明書要求進行操作。
6、試劑盒在運輸與儲存時應該嚴格按照說明書要求來運輸機儲存。
7、本產品的檢測結果非唯一診斷依據，醫生需結合其他診斷方法進行綜合診斷。
8、使用本試劑盒時，應嚴格按照試劑盒規定的樣本類型、樣本要求使用，使用其它類型的樣本可能會得到錯誤的結果。
9、本產品僅適於體外診斷用。試劑中含有液體組分，存在一定的刺激性或毒性，請勿直接接觸皮膚、眼睛。一旦接觸，即用大量清水沖洗。請勿吞服。
10、失效日期已在系統的包裝盒外表面註明，請勿在失效日期後使用。
11、加樣時，每加完一種試劑均需進行離心,避免交叉汙染。
12、 加樣時，注意更換槍頭，避免交叉汙染。
13、儀器開始正常運行時，才可以離開。
【參考文獻】
1. Killela PJ,et al. Oncotarget.2014 Mar 30；5（6）:1515-25
2. Zhang ZY,et al. Oncotarget.2015 Advance Publications .Epub 2015 July 09.
3. 2015版《中國中樞神經系統膠質瘤診斷和治療指南》
【生產企業】
生產企業：上海前迪生物科技有限公司
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