mSystems：不同脂糖比飲食腸道菌群具有相似促肥胖基因和代謝產物

原創 Jione、song 微生態 2019-11-03

導讀

隨著人們生活水平的提高，肥胖已成為大流行病。眾所周知，久坐的生活方式，尤其是高能量飲食是重要的促肥胖因素。有研究顯示，腸道菌群在新陳代謝中起重要作用，而不同的飲食會塑造不同的腸道菌群。高脂飲食（HFD）攝入過多的能量被認為是代謝綜合徵的原因，飲食中的脂肪而非能量也是HFD誘發的實驗性肥胖的關鍵因素。相關研究已經表明，飲食中的脂肪可以通過各種分子途徑調節與脂質代謝和與食慾有關的激素信號傳導相關的基因，但不同的飲食導致相似的糖尿病狀態尚不清楚。研究人員為了解微生物群與早期代謝綜合症之間的關聯，給小鼠餵食兩種能量相同脂糖比不同的高能飲食（HED），使用DNA分離試劑盒提取糞便樣本中的總基因組DNA，參照16S宏基因組測序文庫的樣品製備方案製備測序樣品，隨後進行測序分析，通過RDP分類器方法與Greengenes數據庫比較進行註釋。另外，提取的DNA超聲破碎至100-800bp用於宏基因組的二代測序和生物信息學分析。將細菌、細胞和秀麗隱杆線蟲分別培養，進行微生物和代謝產物的功能分析。結果表明兩種飲食導致不同的微生物群，但糖尿病狀態相似。微生物基因譜沒有顯著差異，並且鑑定了許多常見的代謝產物，包括L-天冬氨酸、膽甾醇-3-醇（5，3）和菜油甾醇，它們與脂肪生成和炎症有關。本研究顯示不同的代謝綜合徵誘導飲食可能導致不同的微生物群，但具有相似的微生物群和代謝組，同時表明宏基因組和代謝組對於肥胖和代謝綜合症的預後和發病機理至關重要。

論文ID

原名：Distinct Gut Microbiota Induced by Different Fat-to-Sugar Ratio High-Energy Diets Share Similar Pro-obesity Genetic and Metabolite Profiles in Prediabetic Mice

譯名：不同脂糖比的高能量飲食誘導的腸道菌群在糖尿病前期小鼠中具有相似的促肥胖基因和代謝產物

期刊：mSystems

IF：6.519

發表時間：2019.10

通訊作者單位：江南大學無錫醫學院＆食品科學與技術學院

DOI: 10.1128/mSystems.00219-19

實驗設計

本研究給5周齡雄性小鼠以NC（對照食物）飲食、高脂（HF）飲食和高蔗糖（HS）飲食120天，並預先測量禁食10小時後的基礎葡萄糖水平。隨後，提取糞便樣本中的總基因組DNA，參照16S宏基因組測序文庫的樣品製備方案製備測序樣品，隨後進行測序分析，通過RDP分類器方法與Greengenes數據庫比較進行註釋。另外，提取的DNA超聲破碎至100-800bp用於宏基因組的下代測序和生物信息學分析。將大腸桿菌菌株OP50、植物乳桿菌ZS2058乳酸菌BB-12和長雙歧桿菌亞種進行培養，通過顯微鏡計數，同時培養秀麗隱杆線蟲，將大腸桿菌OP50加入培養基作為食物，共培養一段時間後，轉移蠕蟲，將大腸桿菌OP50和代謝物添加至S培養基中培養，此時線蟲已經轉移到胞內。經過48h培養後，進行油紅O染色，進行觀察。隨後將OP9胚胎幹細胞和RAW264.7巨噬細胞復甦培養，維持生長狀態。將糞便樣品在甲醇-水（5/1）中勻化，淬滅並超聲處理以釋放代謝物，進行甲硅烷基化衍生化以用於氣相色譜-質譜分析。利用RNA提取試劑盒提取細胞中的總RNA進行熒光定量分析。收集細胞的上清，離心後進行ELISA檢測其中的細胞因子。實驗結果用SPSS進行統計分析。

結果

1 HF飲食和HS飲食均會誘發小鼠前驅糖尿病

常規高能量飲食（HED）餵養120天后，小鼠表現出超重和血糖異常（圖1A至C）。在第40天，飼餵HF但不飼餵HS的小鼠顯示超重（圖1D），空腹血糖改變和葡萄糖耐量降低（圖1E和F）。這些結果表明，HF和HS飲食可能在不同的時程中誘發代謝紊亂。

圖1 HF飲食和HS飲食均誘導小鼠發生糖尿病前期

2 在糖尿病前期小鼠中，不同的脂/糖比會形成不同的腸道菌群。

飼餵HF和HS飲食的小鼠在門和目水平上有明顯的變化（圖2A）。在HF和HS組中，Chao1指數顯著增加，表明菌群豐富度上調（圖2B）。Shannon和Simpson指數表明，飼餵正常對照食物（NC）和HED的小鼠的腸道菌群多樣性沒有顯著差異（圖2B），但樣品根據其飲食卻明顯聚集（圖2C）。加權UniFrac樹分析傾向聚類，表明對照飲食聚類遠離兩個HED聚類（圖2D）。結果顯示，不同糖脂比的飲食在糖尿病前期小鼠中形成了獨特的腸道菌群。

為了進一步研究微生物群的變化，線性判別分析效果量（LEfSe）工具被用於表徵飼餵NC、HF和HS日糧的小鼠中腸道菌群的差異（圖2E和F）。通常，有四個明顯不同的門，對照組中的擬桿菌屬較高，HF和HS組中的放線菌和厚壁菌門分別豐富，而對照組中未檢測到疣狀微生物（圖2E至G）。根據LEfSe分析，將這些豐富的分類單元視為潛在的生物標記物（圖2E）。

HS組分別在屬和家族水平上增加（圖2G）。主成分分析（PCA）顯示，微生物群也根據飲食而聚集（圖2H）。另外，屬水平的變化不代表該屬所有物種的變化（參見圖S1）。結果表明，HF和HS飲食在糖尿病前期小鼠中誘發了兩種與肥胖相關的腸道菌群的不同模式。

圖2 不同的脂糖比在糖尿病前期小鼠體內形成不同的腸道菌群

3 HF和HS飲食豐富了相似的基因譜

宏基因組測序顯示總共檢測到3821個基因。PCA表明，HF和HS組的基因譜很接近，但與對照組的基因譜有很大差異，儘管這兩組之間的細菌種類明顯不同

根據錯誤發現率（FDR）（25％）或P值（5％），縮小到具有最高歸一化富集得分（NES）或顯著集的20個基因集，相似性更大（圖3G）。常見途徑主要為參與脂質和氨基酸的能量代謝和生物合成（圖3H和圖S5）。結果表明，儘管塑造了不同的微生物群，但HF和HS飲食豐富了相似的基因譜。

HF組和HS組的比較發現一些顯著不同的基因集，在圖3H中顯示為紅色條（富含HF組）或藍色條（富含HS組）。HFD優先富集參與能量代謝和氨基酸代謝的基因，而HSD傾向於增加核苷酸代謝相關基因（圖3H和圖S6）。

圖3 HF和HS飲食豐富了相似的基因譜。

4 HF和HS誘導相似的代謝產物譜

在HED餵養的小鼠中，硬脂酸的比例增加，而D-（+）-吡喃木糖（D-木糖），膽甾烷和膽固醇降低（圖4A）。當用十六烷酸（豬油中的主要成分之一）歸一化時，9,12-十八碳二烯酸和硬脂酸的增加以及膽甾醇-3-醇（5，3）的顯著減少

KO02030（細菌趨化性），KO00770（泛酸和輔酶A [CoA]生物合成），KO01230（氨基酸的生物合成），KO00340（組氨酸代謝），KO01200（碳代謝），KO00300（賴氨酸生物合成）和KO02020（兩個的富集組分系統）與L-天冬氨酸的增加一致。KO00061（脂肪酸生物合成），KO00561（甘油脂質代謝）和KO00564（甘油磷脂代謝）的富集可能對應於9,12-十八碳二烯酸和硬脂酸的增加（圖3H，圖4B，圖S5和圖5H）。

在HED組中被還原的1-酰基-甘油-3-磷酸酰基轉移酶（K00655）和磷脂酰胞苷轉移酶（K00981）有助於各種脂肪酸和相關脂質的變化（圖3H和圖4B和C）。L-天冬醯胺酶（K01424），天冬醯胺合成酶（K01953）和天冬氨酸轉氨酶（K00812）的變化導致L-天冬氨酸增加（圖3H和圖4B和C）。木糖異構酶（K01805）的下調將D-木吡喃糖轉化為D-木酮糖，可能導致D-木吡喃糖的減少（圖3H以及圖4B和C）。此外，L-天冬氨酸可以是各種次級代謝途徑（KO01230，KO00240，KO02030，KO00300，KO00770和KO01200）的底物，這些途徑也被富集（圖3H和圖S5和S6）。

圖4 HF和HS模擬相似的代謝物分佈

5 HED調節的微生物和代謝產物影響脂質蓄積

在HED組中，植物乳桿菌在HF、HS和對照日糧中含量低且不變，長雙歧桿菌在三種日糧中含量高而不變；HED組中動物雙歧桿菌減少，而丁酸梭菌有所增加（圖5A）。與大腸桿菌OP50相比，植物乳桿菌ZS2058和動物雙歧桿菌BB-12的攝食量減少，而長雙歧桿菌JCM7053和丁酸梭狀芽孢桿菌MIYAIRI 588增強了秀麗隱杆線蟲的脂質蓄積（圖5A）。另外，HED餵養的小鼠中的大腸桿菌也明顯減少。

在NC和HED組之間，L-天冬氨酸，膽甾烷-3-醇（5、3），菜油甾醇和-生育酚的水平發生了顯著變化，但膽固醇含量相對穩定（圖4A）。與膽固醇相比，類固醇膽甾醇-3-醇（5、3）和菜油甾醇處理可顯著減少脂質積聚，而生育酚則無作用（圖5B）。羅格列酮誘導的脂肪形成受到L-天冬氨酸，膽甾醇3-ol（5，3）和菜油甾醇處理的抑制（圖5C）。膽甾烷-3-ol（5，3）可以降低Cebp的表達（圖5D）。

圖5調脂微生物和代謝產物影響脂質積累

6 HED調節的腸道代謝產物影響RAW 264.7巨噬細胞的活化

L-天冬氨酸可增加炎症性白介素1（IL-1），IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-）的mRNA轉錄，但不增加其蛋白成熟。膽甾烷在mRNA和蛋白質水平上均限制了IL-6的產生。菜油甾醇顯著降低IL-6和TNF-轉錄以及IL-1和IL-6的產生（圖6）。這些數據表明膽甾醇-3-醇（5、3）和菜油甾醇的潛在抗炎作用以及L-天冬氨酸的可能的促炎作用。

圖6 HED調節的腸道代謝產物影響原始264.7巨噬細胞活化

評論

2型糖尿病（T2D）的發生對於患有前驅糖尿病的人來說是不可避免的，其3至5年的發病率約為25％。糖尿病前期可被視為可治癒的疾病狀態和T2D的檢查要點。因此，弄清與糖尿病前期有關的病理生理變化很重要。糖尿病飲食誘發的糖尿病腸道菌群提供了糖尿病的機制。在本研究中，兩種不同的糖尿病飲食（HF和HS飲食）確實誘導了不同的腸道菌群，但具有相似的基因譜。HF飲食富含乳酸桿菌和雙歧桿菌，HS飲食富含阿克曼西亞。據報道，乳酸桿菌和雙歧桿菌同時使用脂肪和糖作為營養物質。生理特徵上的這種差異可能是其差異富集的原因。HF和HS誘導的微生物群之間相似的基因譜可以歸因於脂肪和糖都是能量物質這一事實。在分解成諸如乙酰輔酶A、NADH、FADH2和ATP之類的能量貨幣後，脂肪或糖將在相似基因集的調控下共享相似的下游能量利用和合成代謝過程。

在糖尿病前期小鼠中，乳桿菌、雙歧桿菌和阿克曼蟲明顯增加。這些發現與先前的一些研究相反，這些研究表明它們減少了肥胖症患者並具有抗肥胖作用。但是，糖尿病前狀態的腸道菌群可能與糖尿病患者的腸道菌群不同，乳酸菌、雙歧桿菌和阿克曼菌的升高代表宿主對飲食變化的早期反應。另外，值得注意的是，這些變化是在屬上而不是物種水平上，並且物種的變化通常與整個屬上的不同。因此，對特定腸道環境的物種特異性適應更準確地描述了腸道菌群的功能變化。在本研究中，儘管雙歧桿菌在HED組中富集，但長雙歧桿菌不變，而HED組中的動物雙歧桿菌減少（圖5A）。在功能上，動物雙歧桿菌菌株減少了秀麗隱杆線蟲中的脂質積累，而長雙歧桿菌則增強了該過程（圖5A）。因此，動物雙歧桿菌的減少可能是雙歧桿菌增加的更可靠的前驅生物標誌物。此外，在代謝綜合症的治療中，補充動物雙歧桿菌比抑制雙歧桿菌的整個屬更有益。

腸道微生物相關代謝產物是微生物菌群調控宿主代謝的關鍵介質。通過研究弱極性代謝物，發現在HED和NC飲食衍生的代謝物之間存在一系列差異，尤其是兩種固醇：菜油甾醇和膽固醇3-醇（5，3）（圖4A）。菜油甾醇，一種植物來源的固醇，也是微生物的底物。據報道其與代謝綜合徵呈負相關。膽固醇和糞便中存在膽固醇膽固醇的代謝產物膽固醇。它們的減少還與代謝綜合徵有關。

結論

腸道菌群在宿主代謝中至關重要，尤其是在糖尿病中。然而，儘管與不同的微生物群相關聯，為什麼不同的飲食導致相似的糖尿病狀態尚不清楚。給小鼠餵食兩種能量密度相同但脂糖比不同的高能飲食（HED），以確定微生物群與早期代謝綜合症之間的關聯。兩種飲食導致不同的微生物群，但糖尿病狀態相似。結果顯示，微生物基因譜沒有顯著差異，並且鑑定了許多常見的代謝產物，包括L-天冬氨酸、膽甾醇-3-醇（5，3）和菜油甾醇，它們與脂肪生成和炎症有關。研究表明，不同的代謝綜合徵誘導飲食可能導致不同的微生物群，但具有相似的微生物組和代謝組。

評論

高能量飲食是重要的促肥胖因素，而且肥胖已成為大流行病。基於先前的研究，腸道菌群在新陳代謝中起重要作用，而不同的飲食會塑造不同的腸道菌群。研究人員提出了全球範圍內食物和烹飪方法為何會導致相同的肥胖症表型，基於這個問題，以及先前的研究基礎，本文研究了發病機制關鍵階段的菌群功能變化，探究了微生物群在這中間的重要作用，結果顯示，不同的代謝綜合徵誘導飲食可能導致不同的微生物群。表明宏基因組和代謝組對於肥胖和代謝綜合症的預後和發病機理至關重要。

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關鍵字: 秀麗隱杆線蟲 大腸桿菌 脂糖