在1/3的人類癌症中，3個RAS基因（HRAS，NRAS和KRAS）會發生突變，因而被稱為原癌基因。有趣的是，RAS突變模式截然不同：不同癌症中突變類型以及取代的位置和類型各不相同。由於RAS是多種癌症中最早發生突變的基因之一，因此探究這些突變模式如何產生不僅可以瞭解癌症的發生方式，而且可以瞭解影響影響該事件的因素，這對癌症的預防具有重要意義。
2018年，杜克大學藥理學和癌症生物學學系的Christopher M. Counte教授在《自然綜述·癌症》提出一個觀點：他們認為正常細胞中致癌RAS信號促進腫瘤的發生存在一個狹窄的窗口或平衡點。因此，每個正常細胞中的RAS突變模式都是特定RAS亞型突變的產物，以及突變的位置和替代類型，以達到理想的信號水平。
A model for RAS mutation patterns in cancers: finding the sweet spot
RAS家族屬於小GTPases，包含三個人類基因HRAS、NRAS和KRAS，分別編碼四種蛋白HRAS、NRAS、KRAS4A和KRAS4B，後兩種KRAS異構體是可變剪接引起的（圖1a）。RAS蛋白主要存在於質膜的胞質側，但也可以通過羧基末端添加特定脂質部分而定位到其他膜部位，例如高爾基體膜（HRAS和NRAS）和內體膜（HRAS和KRAS）。當受體酪氨酸激酶激活時，通過募集到質膜上的RAS鳥苷酸交換因子（GEF）將RAS從GDP結合的失活狀態轉換為GTP結合的激活狀態。GTP結合的RAS構象發生改變，其RAS結合域（RBD）可以結合大量蛋白質（效應物），研究最多的是MAPK途徑的RAF激酶，PI3K的p110亞基和RAL GEFs，它們通過一系列信號促進細胞增殖。通過與RAS GTPase激活蛋白（GAP）結合而終止信號，GAP會加速RAS的GTPase活性，使RAS循環到GDP結合的失活狀態（圖1b）。而在1/3的人類癌症中，RAS的單個點突變可以逃避這種精巧的信號轉導。這些點突變大多數會改變氨基酸G12、G13或Q61，從而導致內在和/或GAP刺激的GTPase活性喪失，特別是，G13和Q61處的突變（而非G12）會增加內在的和GEF介導的鳥苷酸交換速率。因此，RAS優先與GTP結合處於活性狀態，這已經被證實具有致癌性（圖1c）。
RAS亞型和信號概述
RAS腫瘤生物學中最有趣但尚未解決的臨床問題之一是，在人類癌症中RAS同工型突變以及突變的取代位置和類型不同。關於同工型突變，KRAS在近四分之一的癌症（主要是腺癌）中發生了突變。NRAS在<10％的腫瘤中發生突變，但在某些癌症（例如黑素瘤或某些白血病）中發生率很高。 HRAS總體上突變頻率相對較低，主要發生在鱗狀上皮癌中。就突變位點而言，胰腺導管腺癌（PDAC）中，KRAS中90％的致癌突變發生在G12，而在黑色素瘤中，NRAS中近90％的致癌突變發生在Q61。儘管在PDAC和非小細胞肺癌（NSCLC）中KRAS都在G12處突變，但在胰腺癌中主要是G12D突變，而在肺癌中是G12C（圖2）。這些模式表明了腫瘤生物學的一些潛在基本特徵，但是又是什麼呢？ 本文中，Christopher M. Counte教授認為RAS突變模式是（至少部分是）腫瘤發生過程中選擇理想信號水平的產物，這取決於RAS突變的功能變化、RAS蛋白水平和細胞對致癌RAS的反應。瞭解這些選擇性壓力可能會揭示腫瘤的發生過程，對癌症預防具有重要意義。
人類癌症中三種RAS基因致癌突變的頻率和類型
RAS突變的時間問題
這些突變模式的一個線索是時機選擇，或者更具體地說，RAS何時發生突變。RAS突變可能是腫瘤發展中的起始事件，早期證據來自對化學致癌物誘導的齧齒類哺乳動物或皮膚腫瘤的分析。 由甲基亞硝基脲（MNU）或DMBA治療引發的腫瘤始終顯示出RAS基因的激活突變，並且在每種情況下，突變取決於起始化學物質的特徵。此後已在胰腺、肺和皮膚的癌前病變中檢測到KRAS或NRAS的突變。人類原發性PDAC或NSCLC腫瘤不同區域的全外顯子組測序顯示，儘管腫瘤內存在遺傳異質性，但在不同區域KRAS突變始終存在，這支持早期起源假說。在小鼠中，由致癌物氨基甲酸酯或MNU誘導的肺部病變的外顯子組測序顯示只有一個複發性突變——Kras。實驗中，向小鼠內源性Kras、Nras或Hras等位基因引入致癌突變可誘導多種組織的癌前病變或低度病變，這些組織單獨或在抑癌基因失活後會發展為明顯的癌症。總而言之，這些發現支持RAS基因是各種癌症中最早（即使不是第一個）發生突變的基因。
RAS和正常細胞
在完全發展的腫瘤中，這些腫瘤在潛在的數十年發展過程中經歷了多種遺傳和表觀遺傳學變化，塑造RAS基因突變模式的因素可能會丟失或被掩蓋。因此，瞭解RAS突變模式的關鍵可能在於突變首次在正常細胞中發生的時間。聚焦於在沒有其他干擾的情況下體內正常細胞中致癌RAS的作用，激活小鼠Kras致癌等位基因可以導致增殖或某些組織器官衰老過程中的增殖，但對其他組織沒有明顯作用。
在激活致癌的Nras或Hras等位基因後也觀察到了不同的反應，這種差異作用可以在細胞水平上體現出來。在胰腺、肺或毛囊的某些細胞類型中激活致癌的Kras等位基因具有致癌性，而在同一組織中的其他細胞類型則不敏感。實際上，在兩個模型中Kras的全面激活會導致一組明確的癌症，其結論是，在沒有其他干擾的情況下，Kras的激活突變並不是普遍致癌的。同樣，在早期幹細胞群體中激活RAS可能會導致腫瘤發展為惡性腫瘤，而無需進一步干預，而在分化程度更高的細胞中激活相同的癌基因可能需要額外的刺激，例如暴露於炎性因子下才能發展，以發展為癌前病變。瞭解RAS會引起哪些反應以及為什麼會發生，應該可以深入瞭解RAS突變模式的根本原因。
“平衡點”模型
RAS基因的一個有趣的地方是，每個異構體的密碼子使用不同，蛋白質表達也相應不同。在基因中經常出現的密碼子被稱為普通密碼子，與強大的mRNA翻譯有關，而那些很少見的密碼子被稱為稀有密碼子，翻譯質量較差。小鼠和人的HRAS cDNA富含普通密碼子，並表達高水平的異位蛋白；NRAS是普通密碼子和稀有密碼子混合，蛋白表達水平處於中間，而KRAS則富含稀有密碼子且翻譯不佳。將小鼠內源性Kras基因的一個外顯子（Krasex3op）中的稀有密碼子變為普通密碼子會增加KRAS蛋白的水平，從而使小鼠對致癌物氨基甲酸酯誘發的肺部腫瘤更具抵抗力。此外，除了在尿烷誘發的腫瘤中發現的Q61R或Q61L（Q61R/L）Kras突變，在Krasex3op等位基因中還恢復了G12D突變。與原發性肺成纖維細胞中的G12D突變相比，KRAS中的Q61R/L突變激活MAPK途徑的程度更高，當引入Krasex3op cDNA時，該突變誘導細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑p16INK4A表達（衰老生長停滯的marker）。總的來說，這些發現表明，表達水平較低的天然Kras等位基因中的“強” Q61R/L突變，至少在肺成纖維細胞中的MAPK活化方面，會誘導增殖，而表達水平較高的Krasex3op等位基因中的Q61R/L突變則誘導衰老，並在腫瘤中無法恢復。支持這些發現的是，細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（Cdkn2a）基因（在小鼠中編碼p16INK4A和p19ARF）失活以鈍化癌基因誘導的衰老，在尿烷治療的小鼠中導致了相似數量的肺部腫瘤，不論Krasex3op等位基因的數量多少。相比之下，在表達不佳的天然Kras等位基因中，由肺成纖維細胞中MAPK激活“較弱” 所定義的G12D突變很少誘導足夠的增殖以引發氨基甲酸酯致癌模型中的腫瘤發生，直到這種突變在高表達的Krasex3op等位基因中發生，超過閾值形成腫瘤（圖3）。
RAS突變模式的“平衡點”
這些發現表明，致癌RAS信號傳導引起腫瘤形成有一個狹窄的窗口或“平衡點”。過多會導致生長停滯，而信號過少則會導致細胞無法增殖。RAS致癌信號轉導的平衡點在不同細胞類型中可能有所不同。這樣，RAS亞型突變的差異以及癌症之間突變的位置和類型，將是針對特定來源細胞中理想信號水平選擇的產物。
RAS突變不盡相同
RAS亞型中最常突變的三個密碼子（12、13和61），都會影響GAP介導的GTP水解，從而使RAS優先與GTP結合並具有活性。每種突變如何實現這一過程並不相同，其中的機制先前已有綜述。這些位置上的取代性質也會影響該循環，而且，這不僅僅是破壞GTPase活性的問題。致癌突變也可能影響與RAS GAP、RAS GEF和效應器的相互作用，這一方面先前已有綜述。一個典型的例子是，Q61L和G13D突變而非G12V突變會加速內在的和GEF介導的鳥苷酸交換。另一個例子是，G12V和G12D突變均降低了對效應器RAF的親和力，但G12V會比G12D更好地激活RAF，因為它更有效地降低了GTPase活性。
RAS信號強度的變化
RAS信號過多
過多的RAS可以抑制腫瘤發生的概念可以追溯到最初的發現，即RAS異位表達誘導人和齧齒動物原代細胞衰老，隨後的發現是在激活內源性Kras癌基因後在小鼠組織中檢測到衰老marker。更直接的證據來自調節小鼠乳腺中Hras-G12V轉基因的水平。低水平促進局灶性上皮增生，而高水平引起衰老並抑制導管伸長。同樣，敲入Kras基因座的Cre可誘導的Hras-G12V cDNA的激活在小鼠的肺部不是致瘤的。 在小鼠肺中激活可誘導的Kras-G12V等位基因導致有限的肺部增生，但在不存在Braf等位基因的情況下，與可誘導Braf-D631A等位基因共激活，可有效激活MAPK途徑，阻斷肺泡病變的發展並引起DNA損傷。重要的是，通過中間劑量的MEK抑制劑降低MAPK信號傳導會恢復腫瘤進展。同樣，小鼠肺中誘導Braf-V600E和Kras-G12D等位基因的同時激活導致信號傳導，會引起衰老marker的升高、肺腫瘤發生的減少。
為了進一步證實過多的癌基因信號轉導的有害作用，通過干擾雙重特異性蛋白磷酸酶6（Dusp6）基因破壞負反饋，前B細胞中NrasG12D的激活會導致ERK超活化、大量衰老和白細胞減少。但是，並非所有細胞都具有這種敏感性，因為在某些造血系統中，NrasG12D的兩個等位基因比一個具有更高的致癌性。
總體而言，在正常細胞中操縱內源性致癌RAS信號的多個體內實例支持以下論點：過多的致癌RAS信號無法支持腫瘤的發生。但RAS信號的多少在不同組織和細胞中式不同的。
RAS信號過少
使用Cre誘導的綠色熒光蛋白（GFP）標記重組的陽性細胞，表明儘管Cre誘導的Kras-G12D等位基因在小鼠的整個細支氣管和肺泡中廣泛表達， 只有II型肺泡細胞會引起腺癌。儘管GFP等位基因的重組可能不一定與KrasG12D等位基因的重組相關，但是當共表達功能低下的Braf突變體或藥理學抑制RAF誘導MAPK通路的反常激活賴增強RAS致癌信號轉導時，會引起支氣管細胞增生，這提示腫瘤起始所需的細胞類型特異性信號傳導閾值。在這方面，更令人信服的實驗可能是採用Cre誘導的Kras-G12V-IRES-β-geo等位基因的實驗，該等位基因可生成編碼Kras和β-geo的mRNA，後者可通過X-gal染色進行觀察。該等位基因在小鼠睪丸、腎臟、小腦、肝和腸中的激活揭示了形態正常的β-geo+細胞，沒有增生性增長的證據，但需要注意的是，IRES–β-geo的存在可能會干擾RAS表達並影響表型。
因此，在正常細胞中沒有其他干擾的情況下，操縱內源性RAS信號的多個體內例子支持這樣一種觀點，即最低水平的致癌RAS信號對於腫瘤的有效起始是必需的，但這又會因細胞而異。
RAS水平的變化
鑑於上述證據表明，致癌RAS信號要麼太強，要麼太弱，都無法誘導腫瘤發生，那麼問題就變成了在獲得致癌RAS突變後，是什麼決定了正常細胞中會發生哪種結果。通常，任何影響RAS蛋白水平的事件都可能影響細胞對RAS的反應。在這方面，RAS基因具有不同的啟動子，可能會影響轉錄並最終影響蛋白質水平。
在小鼠中，在15個成年組織中通過實時定量PCR測定mRNA水平，Kras4b >> Nras ≥ Kras4a > Hras，其中Kras4b佔所有RAS mRNA的70–99％。與此一致，肺通常是小鼠自發腫瘤的一個部位，而Kras是這些腫瘤中突變的主要RAS同工型。但是，這種相關性不適用於肝臟，即自發性腫瘤的另一個常見部位，其中Hras是突變的主要RAS基因。進一步使事情複雜化的是，整個組織中的mRNA水平可能不代表原發癌細胞中的表達。確實，對來自野生型Hras基因座的表達β-geo蛋白的Hrasβ-geo小鼠的檢查顯示，X-gal染色在多種測試組織中不均勻。儘管基因表達肯定會影響蛋白質水平，但是這在三個RAS基因的背景下仍有待充分探討。
總結
可能影響特定RAS突變是否導致腫瘤發生的多種因素使弄清人類癌症中的RAS突變模式極為複雜（圖4）。
導致癌症中RAS突變偏倚的因素
一般而言，建立有效的致癌性RAS突變的基礎的原理可以應用於其他引發腫瘤的情況。其他癌症驅動基因不僅在突變的同工型（例如，BRAF是人類癌症中三種RAF異構體中最常見的突變）存在變異，而且突變的位置（例如，BRAF-G469突變在黑色素瘤很少見，但在肺腺癌中常見）以及取代類型（例如，腦癌中主要的IDH1突變是R132H，而在黑色素瘤中，R132C）也存在變異，這與RAS突變是一致的。
作為信號強度如何塑造突變模式的一個例子，在NSCLC中，RAS依賴性低活性的BRAF突變體比活化的RAS非依賴性的BRAF突變體更常見。這些機能減退的突變也很少與RAS突變或編碼GAP212的神經纖維蛋白1（NF1）缺失或突變同時發生。在黑色素瘤中，情況相反，活化的非RAS依賴性BRAF突變體占主導地位。當檢測到低活性的BRAF突變體時，它們總是與RAS或NF1突變同時發生。這些發現表明，與肺不同，黑素細胞中的基礎RAS激活水平太低，無法與BRAF突變相關。
除引發腫瘤外，關鍵信號輸出的概念還可應用於其他方面，例如在耐藥性方面。一個典型的例子是結直腸癌，其中KRAS中最常見的突變通常在G12位，但是對錶皮生長因子受體（EGFR）治療獲得性耐藥的患者存在豐富的Q61突變。類似地，在BRAF抑制劑vemurafenib耐藥的BRAF-V600E黑素瘤患者中檢測到MEK1突變體表達後，BRAF-V600E黑素瘤細胞系可在BRAF抑制劑存在下達到最佳生長。另一個例子是使用vemurafenib來抑制BRAF突變腫瘤的生長。這些患者由於RAF1的反常激活而發展為皮膚鱗狀癌，幾乎導致僅有HRAS-Q61L突變的鱗狀腫瘤。這些發現提示了在抑制劑存在下實現最佳信號傳導的特定突變的選擇過程。
總之，信號“平衡點”的概念，無論是信號的水平還是組成，都為解開RAS基因複雜的突變譜以及各種人類癌症環境中潛在的其他驅動突變提供了一個方向。
參考資料：Li, S., Balmain, A. & Counter, C.M. A model for RAS mutation patterns in cancers: finding the sweet spot. Nat Rev Cancer 18, 767–777 (2018).
