到目前为止，乙型肝炎病毒（HBV）感染仍然是一大重要的公共卫生问题——全世界目前约有2.4亿人感染乙肝病毒，每年有9万人死于慢性乙肝病毒感染。
HBV是一种DNA病毒，它利用病毒编码的逆转录酶将RNA中间体——称为前基因组RNA（pregenomic RNA，pgRNA）——转化为放松的环状DNA基因组，随后在宿主细胞核内转化为共价闭合环状DNA（cccDNA）。cccDNA作为一个稳定的小分子体保存在细胞核内，并作为所有病毒RNA的转录模板。因此，cccDNA是HBV持续存在的分子基础。
目前，拉米夫定、替比夫定、阿德福韦酯、富马酸替诺福韦二吡呋酯（TDF）、替诺福韦艾拉酚胺（TAF）、恩替卡韦等核苷（酸）类似物（NAs，以下简称为NA）作为抑制HBV复制的药物，几乎在所有患者中都能有效且安全地实现病毒抑制。然而，由于NA是病毒聚合酶抑制剂，只抑制病毒复制，很少能完全根除稳定存在的cccDNA，因此，HBV病毒会持续存在。从理论上讲，终生的NA治疗是必要的，但这对医疗系统来说是一个及其沉重的负担。
虽然NA治疗不会直接影响cccDNA，但预计经过一年的治疗后，患者的cccDNA大约会减少1 log，这可能是由于对细胞核的核衣壳（作为cccDNA的补货）回收不足造成的。因此，一些患者最终可以停止NA治疗。
停止NA治疗的可能指标之一：cccDNA水平
不过，由于大多数患者在停止NA治疗后会经历病毒再激活，所以任何停止NA治疗的策略都必须保证患者的安全，而以此为目的来监测cccDNA水平，理论上是有用的。
然而，将cccDNA水平作为病毒复制和治疗终点的生物标志物有着诸多障碍，包括需要肝活检和缺乏标准化的量化方法。目前用于cccDNA检测的标准方法是 Southern 印迹法，但此方法不能检测到低水平的cccDNA，而且过于复杂且耗时，不适合常规门诊使用。因此，在慢乙肝的管理中，仍需要找到一个敏感度高且方便的生物标记物，用以指导抗病毒药物的停用。
现阶段，国际上的HBV管理指南（AASLD/EASL）推荐使用以下标准来终止HBeAg阳性病例的NA治疗：无肝硬化，至少2-3年的治疗，持续的病毒抑制（HBeAg清除和检测不到HBV DNA），以及有保障的、持续的患者监测。不过，这些标准可能并不总是必要或充分的。
HBV RNA可作为停药新指标吗？依据是什么？
一项多中心前瞻性队列研究中，Fan等人发现HBeAg阳性患者在治疗结束时，相较于 HBV DNA或HBV RNA阳性的患者，HBV DNA和HBV RNA均呈阴性的患者在评估队列中第4年的临床复发风险（n = 25, 8.0% vs n = 102, 31.4%），和验证队列中第5.5年的临床复发风险（n = 13, 15.4% vs n = 27, 33.3%）均显著降低。在研究当中，作者使用的是严格的HBV-DNA阴性定义——即“目标无法检测到”，而不是常用的“低于检测下限”；HBV-RNA阴性定义系“使用不同的引物对 RT-qPCR 检测不到”。
研究人员发现，相较于HBV RNA阳性的患者，HBV RNA阴性的患者在治疗后复发的风险显著降低。根据这些发现，研究人员确定“HBV DNA+RNA”水平是评价队列（替比夫定治疗组）中最强的终止治疗后临床复发的预测因子，且他们在验证队列中（恩替卡韦和替诺福韦治疗组）得到了相似的结果。根据实验结果，研究人员建议使用HBV核酸总水平（HBV DNA+RNA）作为一个可靠的生物标志物，以提示HBeAg阳性患者何时停止NA治疗。
这些分析表明，停止治疗时HBV DNA+RNA双阴性结果，是指导非肝硬化HBeAg阳性患者停止NA的一个有效的指标。
由于HBV RNA是从cccDNA转录而来，所以HBV RNA水平主要反映cccDNA水平。因此，在感染细胞中的HBV RNA水平可以作为cccDNA水平的替代标志物。
事实上，有几项研究也同样证明了HBV RNA水平可有效指导NA的终止治疗，尽管大多数研究是在5-7个小群体中进行的。
待解决的问题有哪些？
基于这些结果，我们能否将HBV RNA水平作为停用NA的临床生物标志物？在将检测HBV RNA水平作为常规临床护理的一部分之前，需要解决几个问题。
首先，应该建立一种检测HBV RNA水平的方法，包括如何从血清中提取RNA、如何对其进行逆转录、应该使用哪些引物、以及这些引物是否适用于不同的病毒基因型。对此，高通量测序技术或液滴数字PCR方法或可用于精确定量。
开发更可靠、可重复且方便的HBV-RNA检测方法，对于常规使用至关重要。近年来，商业化的高通量HBV-RNA检测，如Abbott m2000 RNA检测和Rendu Biotechnology HBV-SAT检测，已被开发出来。但还需制定和研究标准化的方法，以保证HBV-RNA测量结果的可重复性。
其次，必须确定HBV RNA水平的生物学相关性。由于HBV RNA是由cccDNA转录而来的，因此理论上反映了cccDNA水平。
然而，这两项指标并不总是平行的。尽管pgRNA和总HBV RNAs（比如来自RNA剪接缺陷变异体的）存在于从肝细胞释放的病毒粒子中，但HBV RNA进入血液需要几个生物学步骤，如从cccDNA转录、（RNA）被包装成病毒粒子、与血清蛋白结合，还需要HBV RNA能有效地从细胞中释放。
虽然决定HBV RNA水平的主要因素是cccDNA水平，但血清HBV RNA水平可能受到其它多种因素的影响。实际上，HBV RNA水平会随着临床感染阶段和病毒基因型的不同而发生变化。所以，尽快阐明HBV RNA水平的生物学决定因素也很重要。
HBV的另一个复杂的问题是，HBV DNA可以整合到宿主基因组DNA中。低乙肝表面抗原（HBsAg）水平也可能作为停止NA治疗一项标志物，相反，停止治疗时的高HBsAg水平是乙肝复发的独立预测因子。
然而，HBsAg可以从cccDNA和整合的HBV DNA转录，尤其是在HBeAg阴性病例中。虽然HBsAg血清学清除是NA治疗的理想目标，但它只发生在少数患者中（每年<1%）。
展望
血清中HBc相关抗原（HBcrAg）水平也可作为指导停止NA治疗的一种新的生物标志物，它测量的是“核心抗原，HBeAg和22-kDa截段的前核心蛋白”的综合水平。一项已发表的系统性回顾研究建议可以使用 HBcrAg 作为生物标志物来确定可安全停止NA治疗的指标。
目前，NA的终止治疗是一个活跃的研究领域。虽然完全清除cccDNA的治疗方法可能在不久的将来被开发出来，但同时也需要一个简单、安全的停药指导指南。Fan等人的研究为实现这一标准提供了有力的证据。尽管如此，仍需要建立一套测量HBV RNA的通用方法，或考虑联合检测的有效性，如检测HBcrAg、HBsAg和HBV RNA水平。
医脉通编译自：Motoyuki Otsuka, Kazuhiko Koike. HBV-RNA, a new rule for stopping nucleos(t)ide analogues. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 20 August 2019.
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