CRISPR-Cas系統是一類廣泛存在於細菌和古細菌體內保護宿主免受外源病毒入侵的獲得性免疫系統。由嚮導RNA (crRNA) 酶活性的Cas蛋白組成，Cas蛋白在嚮導RNA的作用下可以結合與嚮導RNA互補配對的序列，並進一步切割靶序列。根據Cas蛋白的分類和效應複合物的性質主要分為兩大類Class 1和Class 2，六種不同類型。1類系統包括類型I、III、IV，效應複合物由多個Cas蛋白 (具有一個或多個內切酶活性組分) 組成並與crRNA緊密結合，相反，2類系統包括類型II、V和VI，只有一個具有內切酶活性的多結構蛋白。其中II類CRISPR-Cas系統CRISPR/Cas9系統已經被廣泛用於基因敲除和敲入以及基因組標記等多種方面，極大地方便了基因操作和基因組研究。而VI類系統又叫CRISPR-Cas13系統，是嚮導RNA介導的RNA靶向的內切酶系統，從15年被張峰等人發現至今一共鑑定出四個亞型：VI-A(Cas13a/C2c2)，VI-B(Cas13b)，VI-C(Cas13c)和VI-D(Cas13d)，已經開始運用於RNA的敲低，RNA定點編輯，RNA檢測以及RNA剪接調控。
2019年11月19日，中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（生物化學與細胞生物學研究所）陳玲玲研究組在Molecular Cell雜誌上在線發表了關於CRISPR-Cas13應用於RNA活細胞標記的最新研究進展：Dynamic imaging of RNA in living cells by CRISPR-Cas13 systems。該研究對多種CRISPR-Cas13蛋白進行酶活突變後，篩選出了具有較好RNA標記能力的dPspCas13b和dPguCas13b蛋白，並且使用優化後的CRISPR-Cas13系統可以對胞漿和胞核的非編碼RNA和mRNA進行有效標記。進一步聯合dPspCas13b和dPguCas13b蛋白實現了對活細胞內不同RNA的雙色標記，與CRISPR-Cas9聯用實現了對轉錄RNA和基因位點同時標記。
為了篩選出標記能力更好的CRISPR-Cas13蛋白，研究人員選取了來源於VI-A(Cas13a/C2c2)，VI-B(Cas13b)和VI-D(Cas13d)三個亞型的8個蛋白，對它們的RNA標記能力進行了比較，發現無論是對於細胞核的長非編碼RNA NEAT1還是對於細胞漿的mRNA MUC4來說，來源於VI-B(Cas13b)的dPspCas13b和dPguCas13b都具有較好的標記能力。進一步對嚮導RNA (gRNA) 的研究發現，gRNA的spacer長度在20到27 nt 的長度有較好的標記效果，更長的gRNA反而會降低甚至會失去標記能力。而gRNA的在目的RNA上的靶向位置對dPspCas13b的標記能力同樣有較大差異，進一步說明了RNA的結構對標記能力的影響。研究人員比較CRISPR-Cas13標記系統和傳統常用的MS2-MCP系統發現，MS2-MCP標記系統因為插入的MS2重複元件而具有更強信號，但是會影響目的RNA 表達；而CRISPR-dPspCas13b對目的RNA表達沒有影響。通過對NEAT1所組成的paraspeckle進行動態觀察，發現CRISPR-Cas13標記系統和MS2-MCP對paraspeckles的運動能力都不會產生影響。長時間動態追蹤發現paraspeckles之間可以相互融合和分裂，並提出了“hit-run/fusion”模型，解釋長形paraspeckle的形成過程。為進一步實現RNA單分子水平標記，研究人員構建了一系列帶有不同數目重複元件的RNA序列，發現當目的序列帶有12個及以上重複元件時，通過靶向這些重複元件，dPspCas13b可以在單分子水平實現對目的RNA的標記。此外，聯合dPspCas13b和dPguCas13b蛋白，研究人員實現了對同一RNA和兩個不同RNA的雙色標記，為研究兩個RNA之間的相互關係提供了一個新的工具。此外，聯合CRISPR-dCas13系統與CRISPR -dCas9系統，研究人員也實現了對基因轉錄的RNA和基因位點的同時標記，為研究RNA轉錄和RNA與基因位點的關係，提供了一個簡單和便利的新手段。
圖注：CRISRP-dCas13 在活細胞RNA標記上的應用
據悉，生化與細胞所博士生楊良中與博士生王洋為共同第一作者，陳玲玲研究員為通訊作者。該研究受到了中科院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞分析技術平臺，GE Healthcare Life Sciences（上海）的大力支持。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.10.024
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