CRISPR-U™基因編輯細胞系原理
CRISPR-U™是源井生物自主研發的基因編輯技術（基於CRISPR / Cas9技術），CRISPR-U™技術比普通CRISPR/Cas9技術的基因切割效率更高，同時可以大幅度提升同源重組效率，輕鬆實現細胞和動物水平的基因敲除（KO）、基因點突變（PM）和基因敲入（KI）。利用CRISPR-U™的技術優勢，源井生物已成功在超過100種細胞繫上實現基因編輯。
CRISPR/Cas9系統的原理是利用gRNA特異性識別靶序列，並引導Cas9核酸內切酶對靶序列的PAM上游進行切割，從而造成靶位點DNA雙鏈斷裂，隨之利用細胞的非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）的方式對切割位點進行修復，實現DNA水平的敲除、敲入或點突變。
源井生物100種基因編輯細胞成功案例
技術優勢
基因敲除細胞系
通過病毒法，化學轉染法或電轉法將gRNA和Cas9轉入細胞中，根據轉染方法不同進行不同時長的藥篩，藥篩完成後挑選單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序驗證，篩選出基因敲除的陽性克隆。
常見基因敲除細胞系類型
敲除方案
源井生物根據客戶需求，結合靶基因的情況進行敲除方案設計。
服務流程及質量控制
應用案例
中國倉鼠卵巢（CHO）細胞被用作生物工廠，用於生產一系列重組治療蛋白，包括單克隆抗體和Fc融合蛋白。宿主細胞蛋白（HCP）是必須從治療製劑中去除的雜質，因為它們具有潛在的免疫原性風險。雖然在典型的下游淨化過程中，大多數HCP雜質被有效去除，但清除少量存在的HCP仍然是一個挑戰。利用CRISPR/Cas9系統建立Anxa2和Ctsd基因敲除CHO細胞系，並證實了細胞裂解液中HCP完全消除。在培養過程中，所有的敲除細胞系都顯示出與野生型對照相似的生長和活力。因此，敲除非必需基因可以減少重組治療蛋白生產中HCP的汙染。
用SDS-PAGE和WB分析鑑定CHO基因敲除細胞株的蛋白表達。
（a） Anxa2基因敲除細胞系。
（b） Ctsd敲除細胞系。細胞培養上清液（47μg蛋白）和細胞裂解液（20μg蛋白）經4-20%SDS-PAGE分析。
CBB染色檢測總蛋白。利用各自的捕獲和檢測抗體對每個蛋白質進行WB分析。星號表示非特定波段。雙星號表示組織蛋白酶D的片段。
在蛋白質表達分析中，沒有觀察到CHO-K1（WT）細胞系中的細胞培養上清液中的膜聯蛋白A2和組織蛋白酶D。對貼壁的CHO-K1細胞進行靜態培養，在培養過程中沒有物理應力誘導細胞裂解，這表明CHO細胞分泌的這些蛋白質數量相當少。此外，在對Anxa2和Ctsd基因敲除細胞系的蛋白質表達分析中，沒有觀察到任何截短的HCP。
Reference：
Fukuda, N., Senga, Y., & Honda, S.(2019). Anxa2‐and Ctsd‐knockout CHO cell lines to diminish the risk of
contamination with host cell proteins. Biotechnology progress, e2820.
來源 | 源井生物
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