单B细胞平台种类：包括基于FACS、液滴微流控、微印记、微流控小室等技术的平台；
关注重点：各单B细胞平台都可以实现对单B细胞不同程度的高通量筛选，而基于微流控技术的各平台也展现了其高灵敏度的优势。但能否更高效的应用于新型抗体分子的发现，in-chip assay的能力则是需要进一步考虑的关键点：如果单B细胞平台能实现从特异性到功能性的筛选、并保证assay结果的准确度，则会提高总体筛选的工作效率、减少下游表达验证的工作量、缩短抗体发现的周期。而通过比较可以发现，Beacon平台在assay的种类、操作自动化、结果准确性上面都具有明显的优势。
上一篇我们介绍了单B细胞平台相比于传统抗体药发现平台的优势和特点（从三个月到24小时？一文详解单B细胞分选技术及其优势（上））。那么，市场上有哪些单B细胞平台可以为我们所用呢？
市场上的单B细胞技术平台
基于FACS技术 (FACS-based)
FACS多色分选技术是由Len Herzenberg团队在1960年代基于流式细胞仪发展出的流式细胞分选[1]。FACS利用荧光标记的抗体针对B细胞表面标记物进行染色, 通过流体动力聚焦和换能器的振动将流体割裂成微液滴，每一个液滴中包含等待被分选的B淋巴细胞。这些液滴通过激光产生分选信号，满足筛选条件的B细胞带电液滴最后将被静电场引导到收集管中。抗原结合B细胞被回收后，可被刺激培养并分泌抗体、基于细胞上清的二次筛选、测序与表达。这一平台的优势在于通量较高（10,000 cells/s），技术十分成熟、易于搭建，国内外已有多家公司布局了基于该平台的单B细胞克隆技术。但该技术的限制也同样明显，如灵敏度低、检测噪音高等，导致在后续验证环节中，所筛选出的克隆验证阳性率较低；而且，由于在筛选期间检测手段较为受限，下游验证范围较大，涉及到后期大量的克隆和验证工作。
基于液滴微流控技术 (Microdroplet-based)
基于液滴微流控的单B细胞筛选是指使用油包水液滴将候选细胞进行单细胞包裹，确保其单克隆性，同时将检测所需底物也一同包裹在内，然后对每个液滴进行基于荧光激发的分析与筛选。这一平台的筛选通量也非常高——每秒可达数百个细胞。但这一技术的限制在于检测手段：在目前的研发进展中，只能使用基于均相的检测方法，即无法进一步检测抗体对细胞表面受体的结合或阻断。同时，一般来说包裹于微液滴的细胞活力难以维持，对实验的流程要求较高。目前，Abcellera[2]、Sphere Fluidics[3]等公司搭建的就是基于该类技术的平台。
图1：基于微液滴的单B细胞平台[4]
基于微印迹技术(Microengraved-based)
这一技术由MIT的Christopher Love及其团队开创，又称为SCAN(Single cell antibody nanowells)[5] 。该平台使用软光刻技术，利用PDMS原料在玻璃表面构建出一个个体积约为0.1-1nL的空间，将单b细胞分隔在这些空间中，同时，将附有检测试剂（如抗原、二抗）的表面覆盖于上述表面上，使各单克隆B细胞分泌的抗体参与反应、产生信号，从而达成筛选目的。从该技术的操作过程可以发现，其主要受限于：对于每批细胞，检测方式自动化程度低，导致筛选周期相对较长，且无法满足基于细胞的检测需求。
图2 基于微印记技术的单B细胞平台[5]
基于微流控小室技术(Microfluidic chamber-based)
在利用该技术搭建的平台中，来自于Berkeley Lights公司的Beacon单细胞光导系统可谓独占鳌头，得到了包括Amgen、Novartis、Pfizer等跨国大型药企的青睐。在此，我们通过分析Beacon的原理和工作流程来阐述这一类型的技术：1. 在抗体分泌细胞经过富集后，Beacon平台通过微流控系统将其输送到芯片部位，并且通过重力或光诱导的双向电泳（光导）将单细胞分离到芯片的各个小室中；2. 使用基于磁珠的双色荧光结合实验检各细胞的分泌物，如果细胞能够分泌抗原特异性抗体，则会产生荧光信号，被仪器识别，在这一步骤中，检测试验可以根据需求进行灵活调整，比如改变检测方式、调整抗原形式等；3. 单个阳性细胞通过光诱导的双向电泳被吸取出来，输送到96孔板中，进行进一步的测序、表达。
可以看出，通过整合微流控技术、信号检测系统和光诱导的双向电泳技术，Beacon可以实现自动化的单细胞分选、培养、检测和收集[6]。除了全自动的细胞操控、有效减少人为误差之外，Beacon平台脱颖而出的另一个优势在于，它
可以实现in-chip的多重检测：不仅可以完成基于磁珠的抗原抗体特异性结合检测，也可以利用抗原过表达细胞系检测抗体与细胞表面抗原的结合。除此以外，Beacon可以实现更丰富的功能性筛选，包括阻断实验、交叉活性，表位验证等。另外，不仅检测类型多样，检测的灵敏度也极高，可达1pmol抗体浓度，同时可以记录动态的检测过程（可以观测到信号随时间的变化）；准确度方面，由于Beacon使用了光导技术实现了对细胞的精准操控，下游验证实验中证明假阳性大大低于其他筛选平台的平均水平，阳性率达到99%-100%。
图3 Beacon单B细胞分选平台[6]
我们将各平台的特点列表比较如下。可以看出，各单B细胞平台都可以实现对单B细胞不同程度的高通量筛选，而基于微流控技术的各平台也展现了其高灵敏度的优势。但能否更高效的应用于新型抗体分子的发现，则需要考虑到抗体药开发是一个整体工程，而不仅仅是筛选binder，所以in-chip assay的能力是需要考虑的关键点：如果单B细胞平台能实现从特异性到功能性的筛选、并保证assay结果的准确度，则会提高总体筛选的工作效率、减少下游表达验证的工作量、缩短抗体发现的周期。而通过比较可以发现，Beacon平台在assay的种类、操作自动化、结果准确性上面都具有明显的优势。
表1 各单B细胞平台比较
金斯瑞于2019年底引进了Beacon单细胞光导系统，是亚太地区首家拥有此设备的CDMO公司。在上篇最开始提到的应急抗体筛选中，金斯瑞正是借助于该系统，同时整合了其近20余年的抗体发现经验，在12小时内快速筛选出了特异性识别病毒蛋白和有潜力阻断病毒结合细胞受体的多个抗体（刷新记录24小时，金斯瑞急速助力抗新型冠状病毒抗体筛选取得突破性进展 ）。未来，金斯瑞会进一步将该系统整合进抗体发现平台中，打造出高效的全人抗体开发平台。
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参考文献
[1] L.L. Lanier, Just the FACS, J. Immunol. 2014
[2] www.abcellera.com
[3] www.spherefluidics.com
[4] E. Brouzes et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. PNAS. 106 (34) 2009
[5] J.C. Love et al. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies, Nat. biotechnol. 24 (6) 2006
[6] www.berkeleylights.com
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