原創 莫沉 微生態 2019-09-11
導讀
研究報道顯示，肝硬化和肝性腦病(hepatic encephalopathy, HE)與肝-腸-腦軸改變有關。儘管有研究發現，在抗生素處理之後進行糞菌移植(Fecal microbial transplant, FMT)可以一定程度上改善肝性腦病，然而其對大腦功能的影響尚不清楚。本研究旨在探討通過人源菌群供體移植在無菌小鼠(germ-free, GF)上對其肝-腸-腦軸的影響。實驗通過四氯化碳在GF小鼠和正常小鼠中誘導肝硬化模型，並與GF小鼠和正常對照組進行比較。另外，分別移植來自健康對照組(Ctrl-Hum)和肝硬化患者(Cirr-Hum)的糞便菌群到GF小鼠中。合併使用抗生素後肝硬化患者的糞便(pre-FMT)樣本以及同樣的患者在接受健康供者移植15天后(post-FMT)的糞便樣本。分別利用pre-FMT和post-FMT的樣品製備無菌上清液，用糞便或者無菌上清液對GF小鼠進行體內定植實驗。收集全部小鼠的額葉皮層，肝臟，小腸及大腸組織，分別進行皮質炎症、突觸可塑性和g-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)信號轉導、肝臟炎症和腸道菌群16s多樣性測序。研究發現，與Ctrl-Hum組小鼠相比，Cirr-Hum組小鼠有更為明顯的神經炎症、小膠質細胞/膠質激活、GABA信號傳導和更低的突觸可塑性，上述變化與菌群失調有關，但沒有改變肝臟組織病理變化。Pre-FMT的移植與神經炎症，小膠質激活及菌群失調有關，而上述指標在post-FMT移植中顯著降低。移植pre-FMT和post-FMT的樣品製備無菌上清液對腦功能的各項指標均沒有影響，肝臟炎症未受影響。綜上所述，與健康人相比，肝硬化患者的菌群移植可誘發更高程度的神經炎症及神經元的活化。
論文ID
原名：Neuroinflammation in Murine Cirrhosis Is Dependent on the Gut Microbiome and Is Attenuated by Fecal Transplant
譯名：小鼠肝硬化相關神經炎症依賴於腸道菌群作用並可通過糞菌移植緩解
期刊：Hepatology
IF：14.971
發表時間：2019年6月
通信作者：Jasmohan S. Bajaj, M.D
通信作者單位：弗吉尼亞聯邦大學麥圭爾醫學中心，消化內科，肝病和營養學系
實驗設計
本研究實驗設計如下：A. 菌群定植實驗設計. B. 糞菌移植實驗設計. 其中，Cirr-Hum：移植有輕微肝性腦病的肝硬化患者菌群；Ctrl-Hum：移植健康對照者的菌群。
圖1. 實驗研究設計流程圖
結果
1 不同的菌群移植導致無菌小鼠皮質炎症
與健康對照組小鼠及無菌對照小鼠相比較，肝硬化小鼠IL-1β和MCP1表達水平顯著升高。同時，無菌肝硬化小鼠GFAP, IL-1β, MCP1的表達水平顯著高於無菌對照組小鼠。儘管無菌小鼠中NeuN/Fox3的表達水平沒有明顯差異，肝硬化模型小鼠中NeuN/Fox3的表達水平則顯著升高。此外，與其他各組相比，接受健康對照菌群移植的小鼠BDNF的表達有所升高。與無菌小鼠相比，正常對照小鼠GABRAB1 和 GABRAG1的表達水平較高。
圖2小鼠額葉皮層的mRNA表達水平變化。A. 實驗各組小鼠IL-1b 表達水平變化. B. 實驗各組小鼠MCP1表達水平變化. C. 實驗各組小鼠IBA1表達水平變化. D. 實驗各組小鼠GFAP表達水平變化. E. 實驗各組小鼠NeuN/Fox3 表達水平變化. F. 實驗各組小鼠BDNF表達水平變化. G. 實驗各組小鼠GABRAB1 表達水平變化. H. 實驗各組小鼠GABRAG1表達水平變化. 其中，Cirr-Hum：移植輕微肝性腦病的肝硬化患者菌群；Conv cirr: 四氯化碳誘導肝硬化模型小鼠；Conv ctrl: 正常對照組；GF cirr: 無菌小鼠誘導肝硬化條件下移植健康對照菌群；GF ctrl: 無菌小鼠對照組.
2 肝硬化小鼠及菌群移植肝硬化患者小鼠菌群的差異分析
與正常對照組相比，肝硬化小鼠中Staphylococcaceae, Streptococcaceae,以及 Enterobacteriaceae的相對丰度顯著升高，這使得腸道中Bifidobacteriaceae 及Lachnospiraceae等有益菌的丰度有所降低（表1）。在菌株水平上，與肝硬化小鼠相比，正常小鼠大腸中Akkermansia muciniphila, Lactobacillus reuteri, Ruminococcus torques andRuminococcus bromii的相對丰度相對較高，同時Shigella 和Klebsiella spp.的丰度相對較低（圖3A）。同樣地，與肝硬化小鼠相比，正常小鼠小腸中隸屬於Lactobacillaceae和Lachnospiraceae的丰度較高，而隸屬於Porphyromonadaceae和Staphylococcaceae的丰度則較低（圖3B）。
研究者發現，與移植肝硬化患者菌群的小鼠相比較，化學誘導肝硬化模型小鼠其Enterobacteriaceae, Streptococcaceae, Porphyromonadaceae的丰度較高，同時Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, and Bifidobacteriaceae的丰度較低，這一結果在菌株水平上的分析中也有所體現，例如，移植肝硬化患者菌群的小鼠與誘導型肝硬化小鼠相比，其Ruminococcaceae(Butyricicoccus and Ruminococcus) 以及Lachnospiraceae (Clostridial spp. and Blautia)的丰度較高，同時Klebsiella oxytoca 和 Prevotella copri的丰度較低（圖3C,D）。此外，移植健康對照與移植肝硬化患者菌群的小鼠腸道菌群差異主要集中在較高的Bifidobacteriaceae和Streptococcaceae丰度，以及較低的Enterococcaceae和其他Firmicutes家族的丰度（圖3E,F）。
表1 基於科水平的LefSe菌群差異分析
圖3 菌種水平上的線性判別分析比較分析. x軸表示比較的兩組之間的差異. A. 肝硬化小鼠(紅色)與正常對照組(綠色)大腸粘膜菌群的比較分析. B. 肝硬化小鼠(紅色)與正常對照組(綠色)小腸粘膜菌群的比較分析. C. 肝硬化小鼠(綠色)與移植肝硬化合並肝性腦病患者(Cirr-Hum, 紅色)小鼠大腸粘膜菌群分析. D. 肝硬化小鼠(綠色)與移植肝硬化合並肝性腦病患者(Cirr-Hum, 紅色)小鼠小腸粘膜菌群分析. E. 移植肝硬化患者(Cirr-Hum, 紅色)與移植健康對照菌群小鼠(Ctrl-Hum, 綠色)大腸粘膜菌群分析. F. 移植肝硬化患者(Cirr-Hum, 紅色)與移植健康對照菌群小鼠(Ctrl-Hum, 綠色)小腸粘膜菌群分析.
3 無菌小鼠移植不同來源菌群前後大腦功能的差異變化
與無菌小鼠無論移植pre-FMT 或者post-FMT 狀態下患者的無菌上清相比較，移植糞便菌群的小鼠IL-1β，MCP1，IBA，GABRAB1 和GABRAG1的表達水平較高(圖. 4A-D,G-H)。此外，在實驗所有的假設條件下，移植無菌上清的小鼠其表型與無菌對照組小鼠均類似。與移植pre-FMT糞菌相比較，移植post-FMT糞菌小鼠的IBA 和IL-1β表達較低(圖. 4A,C)。無菌移植的是pre-FMT 或者 post-FMT的糞菌，其GABRAG1和GABRAB1的表達均較高(圖. 4G,H)。然而，GFAP, NeuN/Fox3, 以及BDNF的表達水平均無顯著差異(圖. 4D-F)。
圖4 菌群移植後小鼠額葉皮層的mRNA表達水平變化。A. 實驗各組小鼠IL-1b 表達水平變化. B. 實驗各組小鼠MCP1表達水平變化. C. 實驗各組小鼠IBA1表達水平變化. D. 實驗各組小鼠GFAP表達水平變化. E. 實驗各組小鼠NeuN/Fox3 表達水平變化. F. 實驗各組小鼠BDNF表達水平變化. G. 實驗各組小鼠GABRAB1 表達水平變化. H. 實驗各組小鼠GABRAG1表達水平變化. 其中，GF ctrl: 無菌小鼠對照組; post-FMT all: 混合糞便樣本來自移植健康對照前後的相同患者; post-FMT sup: 來自post-FMT all組糞便的無菌上清液; pre-FMT all:來自肝硬化患者抗生素處理後的混合糞便樣本; pre-FMT sup: 來自post-FMT all組糞便的無菌上清液.
4移植不同來源菌群前後小鼠腸道的菌群差異分析
實驗發現，移植pre-FMT及相同患者在post-FMT之後的糞菌，對小鼠的腸道菌群影響具有顯著差異。與移植pre-FMT患者的糞菌相比，移植post-FMT患者的糞菌小鼠腸道中Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Lactobacillaceae以及Enterobacteriaceae的丰度顯著升高，同時Enterococcaceae 和Streptococcaceae的相對丰度則顯著降低（表2）。在菌株水平上，pre-FMT 供體患者腸道中具有較高丰度的Shigella boydii, Streptococcus spp.,Lachnospiraceae (Lactonifactor和Dorea)以及Bifidobacteria (Bifidobacterium animalis和Bifidobacterium adolescentis)。經過移植健康對照菌群之後，富含Ruminococcaceae和Lachnospiraceae的菌群移植到患者體內，使得隸屬於Lachnospiraceae(Blautia and Clostridialspp.), Bifidobacteria (Bifidobacterium pseudolongum), K. oxytoca, Bacteroides eggerthii, 以及 L. reuteri的相對丰度顯著升高(圖. 5A)。隨後，將上述糞菌移植給小鼠，反應在小鼠小腸菌群的變化要由於大腸菌群變化，可觀察到Lachnospiraceae, Enterobacteriaceae, 以及Bacteroidaceae的丰度顯著升高（表2），而進一步在菌株水平上也具有上述類似的趨勢(圖. 5B,C)，例如Clostridial spp的相對丰度顯著升高。
表2 Pre-FMT和Post-FMT基於科水平上的lefSe 差異比較分析
圖5 菌種水平上進行LEfSe 比較分析. x軸表示比較的兩組之間的差異. A. 移植前供體患者菌群（紅色）和移植後患者供體菌群（綠色）的比較分析. B. 移植pre-FMT患者菌群的小鼠大腸菌群（綠色）和移植post-FMT患者菌群的小鼠大腸菌群（紅色）的比較分析. C. 移植pre-FMT患者菌群的小鼠小腸菌群（綠色）和移植post-FMT患者菌群的小鼠小腸菌群（紅色）的比較分析.
結論
該研究表明，分別移植健康對照組與肝硬化患者的菌群在無菌小鼠上的定殖具有差異，並且這一差異與腦部炎症表達的變化有關。與接受糞菌移植成功後的小鼠相比，使用抗生素處理後，移植肝性腦病患者糞便的無菌小鼠具有更嚴重的腦部炎症。然而，在使用無菌上清液灌胃移植時，未見移植後腦部炎症具有相同程度變化，該結果說明可能是由於移植的菌群介導了小鼠的腦部神經炎症。此外，研究還發現小鼠的腦部對與腸道菌群組成相關的炎症、小膠質細胞，膠質細胞和神經元的激活以及GABA信號通路較為敏感，這種多模態變化已被證明可能會影響人類和動物肝硬化模型中肝性腦病的相關發病機制。在本研究中，研究者發現在無菌小鼠中移植肝硬化患者的菌群可誘發皮質神經炎症和小膠質細胞和膠質細胞活化，該變化與傳統化學誘導的肝硬化模型小鼠表型相似。此外，上述小鼠的腦部功能的變化比移植健康對照的菌群明顯加重，這可能不僅僅是將菌群移植到無菌小鼠體內的非特異性結果。與post-FMT移植組小鼠相比，給予pre-FMT菌群移植的小鼠其大腦皮質炎症和小膠質細胞活化表達明顯增加，這一變化與人類肝硬化病程發展相似，通常肝性腦病在伴隨著炎症、感染和抗生素的使用而更加惡化。
上述研究表明，不同來源的人體腸道菌群定植可能導致不同程度的肝硬化小鼠的神經炎症和GABA通路及神經元的活化。與移植肝硬化患者菌群所引起的神經炎症相比，肝硬化相關的神經炎症更為嚴重。然而，通過對正常無菌小鼠進行post-FMT移植可降低相關神經炎症，這一結果說明腸道菌群可能在該過程中發揮直接作用而不受肝臟炎症或損傷的影響。此外，通過本研究篩選得到的與改善神經炎症相關的菌屬包括Lachnospiraceae以及Ruminococcaceae，該結果也為今後在人體菌群相關移植研究中篩選合適的供體提供重要參考。
評論
肝硬化患者常伴隨著受損的腸-肝-腦軸進而影響疾病的發生和發展。患有肝性腦病的患者往往反覆發作，可導致累積性變化，導致大腦持續性認知障礙。目前，臨床上針對這一疾病的標準治療，包括利福昔明或乳果糖，然而往往不能有效緩解上述症狀。一般來說，肝性腦病的病理生理學是多因素的，包括高血氨症、神經炎症、系統性全身炎症、膽汁酸代謝變化以及GABA信號通路的傳導。在四氯化碳誘導的齧齒動物肝硬化的模型中，無菌小鼠中並不存在類似正常小鼠的肝硬化相關神經炎症的症狀，上述現象提示我們可能與腸道菌群的參與有關。目前尚不清楚由菌群定植引起的腸-肝-腦軸的特定變化，基於此的研究可以為了解在沒有肝硬化的情況下，腸道菌群對大腦神經炎症的作用提供了獨特的視角。
此前的研究已經證明，特定的干預措施，如菌群移植，可能在複發性肝性腦病中改善大腦功能及腸-肝-腦軸的其他變化。此外，對肝硬化以外疾病的菌群移植研究也表明，無菌上清液也可能存在有益的臨床效果。然而，與無菌上清液相比，腸道菌群對肝硬化患者腦功能的影響尚不清楚。基於此，在本研究中，研究者旨在通過移植肝硬化患者與健康對照組來源的菌群對無菌小鼠腦部的炎症,突觸可塑性，GABA信號通路的傳導的影響，以此來反映其對腸-肝-腦軸的影響，同時比較移植肝硬化患者糞便與無菌上清液前後對無菌小鼠大腦炎症的影響。研究證實了移植不同來源的菌群可以導致肝硬化相關腦部炎症的不同的響應，也是肝性腦病患者進行菌群移植後得到改善的部分原因所在，該發現為今後進行相關疾病的臨床實踐提供了重要參考。
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