原創 NEJM醫學前沿 NEJM醫學前沿 1月27日
【編者按】北京時間農曆鼠年春節，《新英格蘭醫學雜誌》發表研究論文A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019。該研究由中國疾控中心領銜，作者還來自北京地壇醫院、武漢金銀潭醫院、湖北疾控中心、中科院生物安全大科學中心、山東第一醫科大學。
因為該文具有重大公共衛生意義，《新英格蘭醫學雜誌》中文版《NEJM醫學前沿》於1月25日發表該文中文官方翻譯。因題目有誤，給讀者造成了誤解，我們深表歉意。我們已刪除原文，1月24日重新發表。未經授權，請勿轉載。
NEJM同期發表一篇社論和一篇觀點，我們亦全文翻譯（《新英格蘭醫學雜誌》權威評論：中國新型冠狀病毒）。另外，The Lancet今日發表2篇研究論文，我們也請讀者關注。
特別緻謝翻譯團隊
侯琦，何群，範齊文，顏婷茹
概述
2019年12月，中國武漢出現了一群與海鮮批發市場有關的不明原因導致的肺炎患者。通過對肺炎患者的樣本進行全基因組測序發現了一種從未見過的乙型冠狀病毒屬（betacoronavirus）病毒。該病毒從感染者氣道上皮細胞中分離出，隨後將其命名為2019-nCoV，這種病毒歸屬於Sarbe病毒亞屬，正冠狀病毒亞科，但形成了另外一簇的進化分枝。2019-nCoV與MERS-CoV和SARS-CoV都不同，它成為可以感染人類的冠狀病毒科中的第七個成員。對該病毒的加強監控和進一步的研究正在進行中（由中國國家重點研發項目和國家傳染病防治重大專項資助）。
介紹
新發和再發傳染病是全球公共衛生面臨的挑戰。冠狀病毒是一種具有包膜的RNA病毒，廣泛存在於人類、哺乳動物和鳥類宿主，可以導致呼吸道、腸道、肝臟和神經系統疾病。已知有6個冠狀病毒屬對人類致病，其中以229E、OC43、NL63和HKU1為主，可以導致免疫功能正常宿主發生普通感冒症狀；另外兩種病毒：嚴重急性呼吸綜合徵冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸綜合徵病毒（MERS-CoV）是人畜共患傳染病，有時與致命疾病有關。SARS-CoV是中國廣東2002年至2003年間暴發的嚴重急性呼吸綜合徵的病原，而MERS-CoV是2012年中東地區暴發的嚴重呼吸道疾病的病原。基於冠狀病毒的高流行率和廣泛分佈，其基因組的巨大遺傳多樣性和頻繁重組，以及人-動物間接觸活動的增加，加之頻繁的跨物種感染和偶爾的動物傳人事件，新的冠狀病毒可能會週期性地出現在人類面前。
2019年12月末，幾家當地衛生機構報告了一組不明原因的肺炎患者，這些患者在流行病學上與武漢的一家海鮮和溼畜批發市場有關。12月31日，中國疾病預防控制中心（中國CDC）派出快速應急小組會同湖北省和武漢市衛生機構進行了流行病學和病原學調查。在暴發的早期，我們報告了這項調查的結果，確定了肺炎集群的來源，並描述了在肺炎患者中檢測到的一種新型冠狀病毒。我們還描述了其中兩名患者肺炎的臨床特徵。
結果
患者情況
2019年12月27日，出現嚴重肺炎症狀的3名成年患者被收入武漢一家醫院。 患者1為49歲女性；患者2為61歲男性；患者3為32歲男性。收集了患者1和患者2的病史： 患者1沒有潛在的慢性基礎病史，但從2019年12月23日出現發熱（體溫37-38°C）、咳嗽及胸部不適症狀。
在臨床症狀出現後4天，咳嗽和肺部不適症狀加重，但發熱症狀緩解，基於CT掃描的結果做了肺炎診斷。此患者的職業為海鮮市場的零售商販。患者2初始症狀從2019年12月20日開始，出現了發熱和咳嗽。在起病後7天出現呼吸困難且後續2天進行性加重（胸片資料見圖1），在此期間進行了機械通氣。該患者曾經常出入海鮮市場採購。患者1和患者3在經過治療後於2020年1月16日出院，但患者2在2020年1月9日死亡，沒有采集到患者的組織標本。
圖1. 胸片
新型冠狀病毒的檢測和分離
2019年12月30日，從武漢金銀潭醫院採集了這3位患者的肺泡灌洗液。 用RespiFinderSmart22試劑盒對這些臨床標本進行了常規檢測，但未發現特異性病原體（包括HCoV-229E， HCov-NL63, HCoV-OC43, and HCoV-HKU1）。對這些患者的肺泡灌洗液進行了RNA提取，作為克隆載體模板；採用Illumina 和Nanopore測序相結合方法進行了基因測序。從單個標本中獲得了超過20,000個病毒序列讀長，大多數序列結果顯示與乙群冠狀病毒屬的B譜系匹配，有超過85%基因序列與此前報到的蝙蝠體內分離到SARS-樣冠狀病毒 (bat-SL-CoVZC45, MG772933.1)有高度一致性。我們對一段RdRp區域的泛乙群冠狀病毒的RNA進行了實時逆轉錄PCR檢測，也得到了陽性的結果 （儘管檢測到樣本循環數閾值高於34）。臨床病毒分離採用人呼吸道上皮細胞和Vero E6 、Huh-7細胞系，分離出的病毒被命名為2019新型冠狀病毒。
為了明確2019-nCoV感染的人呼吸道上皮細胞內可否觀察到病毒顆粒，模擬感染和2019新型冠狀病毒感染的人類呼吸道上皮細胞培養物每天用光學顯微鏡進行觀察，培養6天后用透射電鏡觀察。在人呼吸道上皮細胞表面接種96小時可以觀察到細胞病變。通過顯微鏡觀察，可以看到在視野中央（見圖2），細胞缺乏纖毛運動。 但在Vero E6和Huh-7細胞系培養6天后無特異性細胞病變。
圖2. 人氣道上皮細胞接種2019-nCoV後的細胞培養圖片
負染法電鏡下觀察2019新型冠狀病毒一般呈球形，但有些呈多形性（見圖3）。直徑在60-140nm之間。病毒顆粒有明顯的棘突，大約9-12nm, 導致病毒呈現了日冕狀。在人氣道上皮超薄切片中發現了胞外遊離病毒顆粒和胞質膜囊內充滿病毒顆粒的包涵體。觀察到的這一形態與冠狀病毒科一致。
圖3. 2019-nCoV在透射電子顯微鏡下圖片
為了進一步確定病毒特徵，對患者臨床標本（肺泡灌洗液）和人類呼吸道上皮細胞分離到的病毒用Illumina和Nanopore 進行了測序分析。從這3位患者體內都分離到了新型冠狀病毒。從肺泡灌洗液中獲得了2個全長的冠狀病毒序列（BetaCoV/Wuhan/IVDC- HB-04/2020, BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2020|EPI_ISL_402121），和一位患者體內分離到的病毒全長基因序列(BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2020|EPI_ISL_402119)。這3個新型冠狀病毒全基因組序列已經上報給GASAID組織。(BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019, accession ID: EPI_ISL_402119; BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020, accession ID: EPI_ISL_402120; BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2019, accession ID: EPI_ISL_402121)且86.9%核酸序列與之前報道過的蝙蝠體內分離到的SARS樣冠狀病毒(bat-SL-CoVZC45, MG772933.1)有高度一致性。這3個新型冠狀病毒基因彙總形成了Sarbe冠狀病毒亞屬中的獨立分枝，顯示了典型的乙型冠狀病毒屬結構：一個5′非翻譯區（UTR）、複製酶複合物（orf1ab）、S基因、E基因、M基因、N基因、3′UTR和幾個未識別的非結構開放讀碼框。
儘管2019-nCov與蝙蝠體內分離到的乙型冠狀病毒相似（圖4），但是與SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒有明顯不同。這3份來自武漢的2019 新型冠狀病毒與2份來自蝙蝠體內的SARS樣病毒株ZC45，ZXC21 形成了Sarbe 冠狀病毒亞屬B譜系中一個新的分枝；來自人體的SARS冠狀病毒則與中國西南部蝙蝠體內分離到SARS樣冠狀病毒共同形成了Sarbe冠狀病毒亞屬的另外一個分枝。
2019-nCoV和-冠狀病毒在保守區域複製酶（ORF 1ab）序列一致性方面沒有達到90%，因此2019年武漢病毒性肺炎的可能病原體2019-nCov是一種新型乙型冠狀病毒，屬於冠狀病毒科中的Sarbe冠狀病毒亞屬。
圖4. 2019-nCoV和正冠狀病毒亞科中其他乙型冠狀病毒基因系統發育樹分析圖
討論
我們報道了2019年12月和2020年1月在中國武漢住院患者中發現的一種新型冠狀病毒（2019-nCoV）。該病毒存在的證據包括在三名患者的支氣管肺泡灌洗液中用全基因組測序、直接PCR和培養方法均鑑定出此病毒。這種可能由冠狀病毒引起的疾病被命名為“新型冠狀病毒感染肺炎”（NCIP），完整的基因組已提交給GASAID網站。系統發育樹分析顯示，2019-nCoV屬於乙型冠狀病毒屬；乙型冠狀病毒屬包括了在人、蝙蝠和其他野生動物中發現的冠狀病毒（SARS冠狀病毒、蝙蝠類SARS冠狀病毒等）。我們報道了此病毒的分離及特異性細胞病變作用和形態學的初步描述。
多年來，分子技術已被成功運用於鑑定感染源，全基因組高通量測序是發現病原體的有力工具。二代測序和生物信息學正在改變我們應對傳染病暴發的方式，提高了我們對疾病發生和傳播的理解、加速病原體的鑑別和促進數據的共享。我們在這篇報道中描述了利用分子技術和全基因組測序發現的一種新型冠狀病毒，它可能是導致中國武漢3例重症肺炎的元兇。
雖然建立人氣道上皮細胞培養方法是費時費力的工作，但它是分析人呼吸道病原體的重要研究工具。我們的研究表明，先在人氣道上皮細胞培養物上增殖呼吸道分泌物，再用透射電鏡和全基因測序分析培養上清物，成功地觀察和檢測到了新的人冠狀病毒，這可能是傳統方法無法做到的。
我們還需要進一步建立可準確、快速鑑別呼吸道未知病原體的方法。基於在此研究中得到的3條完整基因組，我們設計了幾個針對2019-nCoV基因組的ORF1ab、N和E區域的特異和敏感的檢測，可以檢測出臨床樣本中的病毒RNA。引物集和標準操作程序已與世界衛生組織共享，用於在全球和中國監測和檢測2019-nCoV感染。最新的數據顯示，中國已有830人檢測出2019-nCoV。
雖然我們的研究沒有完全遵循科赫法則，但我們的分析提供了武漢暴發2019-nCoV的證據。我們還需提供有關2019-nCoV引起武漢疫情的其他證據，包括在患者的肺組織中用免疫組化方法檢測到2019-nCoV抗原，從同一患者兩個時間點的血清標本中檢測出可證實血清轉化的抗病毒IgM和IgG抗體，以及來自動物（猴子）實驗的致病性證據。至關重要的是進行流行病學調查，以確定感染的傳播方式、繁殖間隔期和感染的臨床症狀譜，從而為制定預防、控制和制止2019-nCoV傳播的戰略提供指導。
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