對蘇偵察
託尼·萊維爾承擔起培訓中情局U-2飛行員的任務，儘管駕駛該機很困難，但飛行員們很快就喜歡了U-2A，部分原因是駕駛它是一項挑戰，並且U-2擁有其他飛機無法比擬的高空飛行能力。當然飛行員們也為成功付出了代價，僅在1956年就發生了四起事故，導致三名飛行員遇難。
中情局在51區的U-2A機隊，垂尾以NACA的名義進行掩護
到1956年春，U-2似乎已準備就緒，可以開始執行作戰任務了。4月中旬，該機在美國上空進行了8次模擬偵察，測試結果令人滿意，很快U-2就被批准部署英國萊肯希思空軍基地。但在4月19日，一名叫萊昂內爾·克拉博的英國蛙人奉命在水下對訪問朴茨茅斯港的蘇聯海軍巡洋艦布放竊聽裝置，結果就此神秘失蹤，英國人不想冒險再次挑釁蘇聯，沒有同意U-2進駐。
U-2的對蘇飛越被視為當務之急，該機很快被重新部署到西德威斯巴登，並正式成為“第一氣象偵察臨時中隊”的一部分。這支作戰中隊實際上被簡稱為“A支隊”，由一位美國空軍上校指揮，中情局官員擔任執行官。U-2的首次作戰發生在1956年6月20日，飛越了東德和波蘭。由於此次任務進展順利，艾森豪威爾授權該機飛越蘇聯。
技術問題和惡劣天氣使U-2的第二次任務被推遲到1956年7月2日，兩架U-2飛越了7個東歐國家。1956年7月4日，該機執行了首次對蘇飛越任務，飛行員赫維·斯托克曼從威斯巴登起飛後，飛越波蘭波茲南、白俄羅斯、列寧格勒，然後折返飛過波羅的海國家。這次任務的具體目標是蘇聯潛艇碼頭和空軍基地，尋找“野牛”戰略轟炸機的身影。
U-2的6月20日、7月2日任務航線
第二天7月5日，卡邁·維託駕駛U-2飛過莫斯科。這座城市被雲層覆蓋，不過相機通過霧霾濾鏡還是拍到了一些照片。這次任務還獲得了莫斯科附近茹科夫斯基航空城以及一些火箭和飛機工廠的高質量圖像。U-2在7月9日和10日又進行了三次任務，覆蓋了東歐和蘇聯西部大部分地區。
卡邁·維託成為唯一飛越了莫斯科的U-2飛行員
U-2的7月4、5日任務航線
隨後對蘇飛越被叫停，因為儘管中情局寄希望於蘇聯雷達無法發現飛在高空的嬌小U-2，但該機在所有飛越任務中都被發現和跟蹤，蘇聯人甚至在7月5日緊急出動截擊機試圖擊落卡邁·維託，但因無法觸及如此之高的目標而作罷。
卡邁·維託拍到的製造“野牛”戰略轟炸機的工廠
1956年7月10日，蘇聯向美國遞交了一份正式抗議，詳細描述了U-2侵入蘇聯領空的一些飛行軌跡，當天理查德·比塞爾接到了暫停任務的命令。
U-2的7月9、10日任務航線
U-2的對蘇飛越帶回大量情報，照片表明蘇聯空軍的戰略核打擊能力被嚴重誇大，“野牛”轟炸機的數量遠小於蘇聯聲稱的100架。事實上多年之後的解密數據證明“野牛”也遠稱不上可怕，其航程根本達不到蘇聯空軍的要求。
中情局的U-2飛行員
“鞦韆”和“壁紙”
蘇聯能發現並跟蹤U-2的事實立即引發中情局的焦慮，開始嘗試降低U-2的雷達截面積，讓該機不那麼容易被蘇聯防空雷達發現。該項目就是麻省理工學院牽頭的“彩虹”項目（RAINBOW），科學家們提出了兩種得到實際應用的隱身解決方案，分別是“鞦韆”（Trapeze）和“壁紙”（Wallpaper）。
現在看來，“鞦韆”方案有些荒謬，先是用竹子然後用玻璃纖維製造的支柱在機身和機翼周圍撐起串有精確間隔鐵氧體磁珠的導線，用於吸收70MHz雷達波。但“鞦韆”增加了U-2的重量和阻力，降低了飛行高度。
U-2的“鞦韆”隱身改進
“壁紙”就是印刷了電路的塑料貼片，被用於吸收65MHz至85MHz的雷達波，被貼在機頭、尾翼和機身等部位。“壁紙”的缺點是會導致發動機過熱，實際上1957年4月一架貼有“壁紙”的U-2A就因過熱而導致發動機熄火，使洛克希德試飛員羅伯特·斯萊克在跳傘時撞到了尾翼身亡。
U-2的“壁紙”隱身改進
毫不奇怪，“凱利”約翰遜不喜歡“彩虹”項目的隱身改進，把這種U-2稱為“髒鳥”。但該機還是從1957年7月開始作戰，不幸的是經過九次對蘇飛越後，中情局意識到“彩虹”隱身改進幾乎完全無效，於是在1958年5月放棄了該項目，U-2的對蘇飛越再次被禁止。洛克希德開始為該機嘗試使用黑色的雷達吸波塗料（RAM）。
從1956年11月下旬開始，U-2從威斯巴登起飛進行了更多架次間諜飛行，但為了降低風險該機只是靠近邊界飛行。5月中情局在土耳其因吉爾利克空軍基地部署了B支隊，U-2從這裡飛越西奈半島，偵察英法軍隊對埃及的入侵。1957年B支隊接管了對東方國家的偵察任務，該支隊在年底前合併入A支隊，一些越境飛行將從巴基斯坦拉合爾起飛。
中情局U-2除了垂尾編號外沒有其他任何標記
英國人也參與了該計劃，提供飛行員並獲得一架U-2的所有權。英國空軍飛行員先是飛越中東，然後又飛越了蘇聯。除此之外中情局還在日本厚木基地部署了C支隊，D支隊則駐紮加州愛德華茲空軍基地執行國內偵察任務，這是因為格魯姆湖附近正在進行核試驗。
美國空軍戰略空軍司令部（SAC）在德克薩斯州勞克林空軍基地建立了自己的U-2部隊，即第4080戰略偵察聯隊第4028戰略偵察中隊，在1957年7月獲得了首架U-2A。該中隊執行的任務是高空大氣採樣，部分U-2A經過改裝在機鼻增加了一個進氣口並在Q艙右下方多出一個整流罩鼓包，這就是用於執行高空樣本項目（HASP）的WU-2A，“W”表示氣象偵察機。
WU-2A
此時中情局U-2執行了最重要的任務，該機拍攝了蘇聯境內的一系列戰略目標，尤其是哈薩克斯坦拜科努爾火箭發射中心，這裡也是丘拉塔姆導彈靶場所在地。D支隊也從阿拉斯加的埃爾森空軍基地起飛對西伯利亞進行偵察。
1957年以後U-2的對蘇飛越次數急劇下降，到1958年只進行了一次，1959是兩次，主要是風險較低的目標。雖然U-2在最初的任務中仍裸露著金屬蒙皮，但現在已經被黑色的鐵氧體雷達吸波塗料所覆蓋，以降低其雷達可見性。
全機黑色的中情局U-2B
好運快要到頭
到1959年末，美國開始擔心蘇聯洲際彈道導彈（ICBM）的發展，因為從斯普特尼克1號人造衛星開始，蘇聯使用R-7火箭進行了許多令人印象深刻的太空發射，這種火箭能派生出搭載核彈頭的洲際彈道導彈。蘇聯總理尼基塔·赫魯曉夫也大聲宣佈蘇聯已經具備了大規模生產洲際彈道導彈的能力。蘇聯和美國之間的“導彈差距”似乎正在加大，這必須通過偵察驗證。此時中情局正在進行一個代號“日冕”（CORONA）的間諜衛星計劃，但發射並不順利，必須還要依靠U-2。
參與U-2項目的每個人都知道，蘇聯最終將發展出擊落該機的能力。到1960年初，蘇聯開始大規模部署SA-2“導線”地空導彈，這種導彈具有了攻擊高空U-2的能力。不過中情局認為值得賭一把，U-2可以從巴基斯坦起飛，利用蘇聯南部國土防空網絡薄弱的機會來執行最後一系列飛越。事實證明，美國人的好運到頭了……
發射中的SA-2地空導彈
U-2的繼續飛越讓蘇聯人瘋狂起來，他們試圖用米格-19或米格-21戰鬥機以及躍升戰術獲得射擊機會，甚至米格-19還在機腹安裝了大型液體燃料火箭助推器，試圖爬升到U-2所在高度。但是在空氣稀薄的高空，這些戰鬥機的空氣動力學性能就像磚塊一樣。
米格-19SU U-2截擊機
雖然U-2飛行員有時會看到蘇聯戰鬥機從下方飛過，甚至有時會擔心空中相撞，但蘇聯戰鬥機從未佔據過射擊位置。事實上在幾次攔截中，蘇聯飛行員的確接到了抓住機會撞落入侵者的命令，然後再彈射逃生。蘇聯戰鬥機還會在較低高度跟隨U-2飛行，希望該機因無法長時間維持高空飛行或因故障而降低高度。
U-2從巴基斯坦起飛成功完成了幾次對蘇飛越，但很快該機的好運氣就要被耗盡了。1960年5月1日，中情局最富經驗的U-2飛行員，執行過27次偵察任務的弗朗西斯·加里·鮑爾斯從巴基斯坦白沙瓦起飛，開始執行“大滿貫”行動（Operation GRAND SLAM）的第24次對蘇飛越，按照計劃該機將降落在挪威博多。鮑爾斯駕駛的是一架換裝進一步增強高空性能的J57-P-31發動機的U-2B，從某種程度上看這是一架不祥之機，曾迫降在日本的一個滑翔機機場，被媒體拍攝了大量照片。
迫降日本的U-2B
擊落鮑爾斯
鮑爾斯的任務是拍攝丘拉塔姆導彈靶場，然後在斯維爾德洛夫斯克附近的車里雅賓斯克飛越一個可疑發射場，最後偵察新建的普列謝茨克發射場。當鮑爾斯飛越丘拉塔姆時，蘇聯防空軍開始密集攔截，米格-19戰鬥機試圖躍升到高空，但沒有成功。蘇聯人也開始發射SA-2地空導彈，甚至擊落了一架蘇聯戰鬥機並殺死了飛行員。蘇聯人的瘋狂攔截最終獲得成功，當鮑爾斯接近車里雅賓斯克時，一枚SA-2在附近爆炸，把機翼從機身上扯脫，U-2開始翻滾著向地面墜落。
鮑爾斯的偵察航線
從受傷的U-2裡逃生很麻煩，該機有一套自毀系統，會在飛行員彈射離機後延遲引爆。系統不會完全摧毀飛機，但會摧毀機密的相機裝備。曾有傳言說自毀系統並不會延遲引爆，以確保飛行員被同時“自毀”，當然這種說法是毫無根據的。儘管如此，自毀系統的存在仍使飛行員感到緊張，如果延遲失效怎麼辦？如果延遲時間沒那麼長怎麼辦？所以鮑爾斯在打開自毀開關上的保險蓋時，他認為最明智的做法是先不去動它。
加里·鮑爾斯
鮑爾斯在翻滾著的U-2中被緊緊壓向前方，如果此時強行彈射，他的雙腿膝蓋以上部位就會被儀表板切斷。他決定手動逃生，首先拋掉座艙蓋，然後鬆開安全帶，他半個身體立即從座艙中被拋了出來。他試圖打開自毀開關，但頭盔護目鏡已經被呼出的凝結水汽搞得一片模糊，經過徒勞的摸索後，他離開了飛機，開傘降落到地面。
電影《間諜之橋》中U-2被擊落的情景
蘇聯人俘虜了鮑爾斯並收集了U-2B的所有殘骸。降落到地面後，鮑爾斯從銀元中取出毒針並藏在藏在飛行服口袋裡，蘇聯人最終搜出毒針並拉來一條狗進行測試，狗子瞬間死亡。
U-2的毒針
U-2沒能在預定時間降落挪威嚇壞了美國人，他們意識到該機終於被蘇聯人擊落，但感覺鮑爾斯無法在高空跳傘中生存下來。於是美國人很快拋出了U-2只是一架偏離航線誤入蘇聯領空的氣象偵察機的官方說法，為了配合這種說法，美國宇航局還向公眾展示了塗有NASA白色塗裝U-2，並宣佈該機已經為NASA執行了數百架次飛行。
被公開展出的U-2殘骸
蘇聯人不動聲色坐看美國人的表演，然後突然向全世界公佈了U-2的殘骸並對鮑爾斯進行了公開審判。U-2偵察機被擊落時間在一夜之間成為了全世界關注的焦點，美國人被狠狠打了一記耳光。
被公開審判的鮑爾斯
鮑爾斯作為間諜被判處十年監禁，最後在1962年初與蘇聯間諜魯道夫·阿貝爾交換得以返回美國。鮑爾斯回國後被指控為叛國者驅逐出中情局，他在1977年的一次直升機墜毀中喪生。
這是U-2最後一次飛越蘇聯，由於“日冕”項目已經步入正軌，實現了使用間諜衛星偵察蘇聯，因此不再需要危險的偵察飛行。中情局的U-2機隊規模被大幅縮減，十幾架U-2中有一半被移交給美國空軍，駐紮在土耳其的支隊被撤銷。當然這並不是U-2服役生涯的終結，該機在接下來的數十年時間裡還將持續進化。
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