循環遊離DNA在結直腸癌診療中的應用進展

單位：廣州市第一人民醫院、華南理工大學附屬第二醫院消化科

結直腸癌(CRC)是常見的消化系統腫瘤之一，近年來其發病率有逐漸上升趨勢。研究顯示，CRC居我國癌症發病率和病死率的前5位。一直以來，CRC篩查工作以糞便潛血結合結直腸鏡為主，但面臨內鏡診斷流程多、患者依從性差、社區宣教普及困難等缺點。因此，尋找一種能夠對CRC進行早期診斷和預後評估的腫瘤標記物刻不容緩。循環遊離DNA(cfDNA)是1948年發現的細胞外碎片DNA，主要來自細胞壞死、凋亡。腫瘤細胞釋放的cfDNA通常稱為循環腫瘤DNA(ctDNA)，其中一些能反映腫瘤的特異性特徵，包括體細胞突變和異常的DNA甲基化模式，被認為是極具臨床運用前景的腫瘤標記物。與組織活檢比，檢測ctDNA有許多方面的優點:(1)檢測方法相對微創；(2)ctDNA能很好地代表患者腫瘤的特徵，有很高的特異性；(3)通過動態監測ctDNA定量和定性變化，可實時對患者的疾病復發和治療療效進行判斷；(4)檢測ctDNA能全面地瞭解腫瘤的遺傳學信息，避免組織活檢因腫瘤的異質性而漏掉腫瘤部分生物學特徵，從而更好地對患者的個體化治療提供選擇。本文結合國內外關於cfDNA的最新研究，對目前檢測cfDNA的方法和cfDNA在CRC中的應用進展作一綜述。

1.cfDNA檢測方法

腫瘤細胞釋放的cfDNA佔外周血總cfDNA很小一部分，所以需要高敏感性的方法對其進行檢測。常用的檢測方法包括聚合酶鏈反應(PCR)和二代測序(NGS)包括全基因組測序和全外顯子組測序等。基於實時PCR的檢測方法廣泛地應用於檢測低線(LoD)為0.1%-0.5%的cfDNA測量，但當cfDNA用於檢測或監測早期疾病時，ctDNA的比例往往低至0.01%。最近發展出許多基於PCR改進的檢測方法，包括基於等位基因定量PCR的Intplex技術，其敏感性範圍為0.004%-0.014%，以及乳液PCR技術如微滴式數字PCR(ddPCR)、BEAMing數字PCR等，其敏感性範圍為0.001%-0.01%。PCR可對cfDNA中的遺傳學改變有較好的檢測，但存在每次只能分析少量位點的問題。而運用NGS可以在一次測序中同時對全基因組的遺傳學改變進行測量，能顯著提高早期CRC患者cfDNA中體細胞突變的鑑定，但全基因組和全外顯子組測序的缺點是對於cfDNA的檢測分析敏感性很低。新近出現的靶向測序方法，將分子條碼和適當的生物信息學篩選步驟與DNA片段的深度測序結合起來，從而對其敏感性有所改進。除此之外，還有亞硫酸鹽測序法、特異性化學標記法(hmC－Seal)等檢測cfDNA中的表觀遺傳學特點，為cfDNA的檢測賦予了更深層次的意義。

2.cfDNA在CRC診療中的應用

2.1 cfDNA與CRC的診斷

cfDNA檢測有微創性優點，使得這一方法可能成為腫瘤早期篩查的新手段。大量研究表明，cfDNA水平的增高可能提示腫瘤的發生，不過cfDNA不僅來源於腫瘤細胞，也來自正常細胞的壞死和凋亡，故在循環中含量很低，易受多種因素影響。特別是當處於早期疾病時cfDNA的含量更低，所以利用cfDNA水平進行CRC篩查的敏感度和特異度都較低。Kopreski等在8例CRC患者中成功檢測到其中5個KRAS突變的存在，但也在170個正常的沒有腫瘤表現的個體中檢測到37個有KRAS突變變化。與腫瘤相關的基因突變在少部分正常個體中也能被檢測到，有些研究發現來自健康個體的樣本中有0.45%-20%的cfDNA存在基因突變，尤其是TP53和KRAS突變，但結合甲基化水平能夠提升cfDNA的敏感度和特異度。

甲基化是表觀遺傳學的一種改變形式，在2004年，Belinsky指出超甲基化可能是癌症發生和進展的關鍵因素。血漿cfDNA甲基化特徵的檢測相比cfDNA的定量和腫瘤特異基因突變水平，對腫瘤的早期診斷有更高的特異性。Liu等對68例終止治療的常見晚期癌症患者血漿cfDNA中9 223個持續超甲基化CpG位點進行了全面的靶向甲基化測序，並以此進行甲基化評分，成功檢測出57例患者癌症的存在且準確分辨出45個的潛在腫瘤類型，其中，甲基化評分對於CRC探測和分類的準確度最高，分別為96.3%、88.5%。

甲基化模式於腫瘤病理的早期出現，而且在CRC腫瘤中表現突出，這些特點都使得它對CRC的篩查有著重要的意義。血漿中的循環SEPT9 DNA是目前對於診斷CRC的一種研究較多的甲基化標記物。Church等進行了一個大型的前瞻性研究，評估循環甲基化SEPT9 DNA在篩查人群中檢測CRC的準確性。他們納入了7900例計劃做內窺鏡的參與者，發現其中53例CRC患者，循環甲基化SEPT9 DNA在篩查人群中檢測CRC的敏感度和特異度分別為48.2%、91.5%，檢測晚期腺瘤的敏感度為11.2%。上述結果顯示，血漿中的循環SEPT9 DNA是CRC的潛在腫瘤標記物。類似基於甲基化cfDNA的研究眾多:如IKZF1/BCAT1、NPY/WIF－1、ALX4、APC、SFRP2、SDC2等。結合多個甲基化生物標記物能提高cfDNA對CRC的早期診斷能力，但這仍需要更多的臨床研究證明和敏感度更高的檢測技術支持。

此外，DNA的羥甲基化也是表觀遺傳學的重要組成部分。5－羥甲基胞嘧啶不僅是主動去甲基化過程中的中間媒介，而且作為一個穩定的DNA標記，在腫瘤的早期診斷中發揮著至關重要的作用。已有研究發現，通過CRC患者和健康對照者血漿中5hmC的差異信號，能很好地分辨出CRC患者，利於CRC的早期診斷。總的來說，通過追蹤cfDNA中的表觀遺傳修飾特點，我們可以進一步追溯該異常cfDNA的來源組織，從而實現對於CRC及其轉移的早期診斷。

腫瘤的異質性一直是腫瘤治療研究難以攻克的大難關，使得很多抗癌治療無法達到預期效果。cfDNA的動態變化為腫瘤異質性和腫瘤進展評估提供了更便捷的方法，並且在時間上比常用的影像學方法能更早地判斷治療效果。de Figueiredo Barros等分別檢測了組織樣本(原發和轉移性)和血漿樣本中5個腫瘤相關基因突變，血漿樣本檢測到的突變種類明顯多於組織樣本。同時，血漿樣本中ctDNA突變頻率也隨著化療進行而變化。在治療期間，計算機斷層掃描(CT)對於疾病進展的預測明顯晚於ctDNA。在Janku等的研究中，通過相關性分析，表明經歷全身治療患者中cfDNA VAF的變化與對放療反應呈正相關。

cfDNA中的異常甲基化模式也可用來評估CRC患者的治療療效。Bhangu等的研究納入34例肝切除術前接受新輔助化療治療的CRC肝轉移患者，並收集患者基線及每次新輔助化療週期前外周血血漿，分析48個CRC相關基因的異常甲基化。他們發現甲基化標誌物水平與腫瘤基線體積和治療反應相關，且具有較高的敏感度和特異度，通過對CRC相關性甲基化標記物的連續測量，可能對於接受新輔助化療的CRC肝轉移患者的早期療效評估有一定價值。

在cfDNA中，部分腫瘤特異性變異與腫瘤預後有很好的相關性，如KRAS、BRAF等，常被用來檢測癌症患者的預後。Perets等用二代測序技術(NGS)對17例轉移性胰腺導管癌患者血漿ctDNA進行KRAS突變分析，發現5/17(29.4%)患者血漿KRAS突變，且KRAS突變與更短的生存期相關；Janku等在一項針對55例晚期癌症患者的研究中，用超深下代測序(ul-tradeep NGS)對61個癌症相關基進行突變分析，發現cfDNA變異等位基因頻率(VAF)高的患者，比VAF更低者存活時間更久。通過治療前後cfDNA中腫瘤特異性遺傳學變化，我們可以監測腫瘤的進展可能，預測患者的無腫瘤生存期和選擇針對性更強的靶向藥物，實現精準的個體化治療。最近抗腫瘤二、三線治療的研究數據表明，檢測到cfDNA中KRAS突變的CRC患者對於抗表皮生長因子受體(EGFR)靶向藥物治療的療效很差。Wong等的實驗也支持這一觀點，他們研究顯示，在瑞戈非尼治療期間，能在血漿中檢測到KRAS突變的CRC患者相比檢測不到KRAS突變患者，前者PFS更短。

cfDNA中的耐藥突變也可作為監測CRC發展的良好指標之一。有一個研究觀察到KRAS突變克隆隨治療而波動，在進展時KRAS等位基因的改變相對增加，而在EGFR阻滯劑停藥後則下降。Bettegowda等對比24例正進行抗EGFR治療的轉移性CRC患者實體瘤樣本，發現其血漿ctDNA中的耐藥突變也能檢測抗EGFR耐藥性。他們不僅檢測到了KRAS基因突變，還檢測到了在疾病進展時的KRAS擴增，而這些基因變化都可以通過對cfDNA的檢測而探測到。利用這些cfDNA改變，我們可以動態地觀察腫瘤進化，據此調整抗癌方案，使得患者有更好的療效和更少的毒性不良反應。

除cfDNA中的腫瘤特異性遺傳學變化，cfDNA的總量也被認為是CRC預後判斷和發展監測的潛在生物標誌物。Bettegowda等的研究首次發現KRAS突變片段的水平和CRC患者更短的總生存時間相關。Bedin等納入了114例CRC患者，與65例健康受試者和22例腺瘤病灶患者進行預後評估研究，結果顯示cfDNA水平升高與預後不良密切相關；一項對2003—2014年發表的包括1022例CRC患者9項研究的Meta分析表明，cfDNA的定量檢測可預測無復發生存時間(RFS)和總生存時間(OS)。但由於不同檢測cfDNA技術的敏感度和特異度的不同，導致檢測出的cfDNA水平也有差異，從而造成對疾病預後的估計有所偏差。最近一個研究將18 F－FDG PET/CT所測得的全身基線代謝活性腫瘤體積與cfDNA基線水平結合起來，對轉移性CRC患者的預後也有很好的預測作用。

通過對cfDNA的定量、特異性基因突變和甲基化形式的檢測，我們可以將其運用於對CRC早期疾病和治療性手術後微小殘留灶的檢測、復發評估、治療療效和化療耐藥的評價，而這些在目前的研究中已經取得了很多進展。不過，將cfDNA的檢測轉化為臨床應用仍有一定障礙。目前對於cfDNA的檢測技術並沒有標準化，這使得各個研究所測的cfD-NA結果存在較大差異。我們已經知道cfDNA來源於細胞壞死、凋亡以及少部分細胞的主動釋放，但對於cfDNA的來源和生理特徵我們理解得並不深入，這些知識和檢測技術的發展也是相輔相成的。此外，將cfDNA的檢測用於臨床還需要建立標準化的分析前程序，包括血漿的收集、獲取和儲存、cfDNA的抽取等。cfDNA由於自身性質和腫瘤異質性，利用其水平對腫瘤的檢測敏感度和特異度並不高，需要發展更靈敏和特異的檢測技術和更具特異性的cfDNA特徵作為標記物。此外，cfDNA在體內含量低，也存在於健康個體中，不同時期的結直腸癌患者cfDNA檢測時間是變化的，這些都為cfDNA的臨床價值帶來影響。

總的來說，未來仍需要大樣本量、前瞻性、多中心隨機對照實驗來驗證cfDNA在CRC診療中的作用，並結合多種cfDNA標記物，提高檢測的敏感性和特異性。除此之外，我們還應該加強對cfDNA的基礎和技術研究，以及早日達到檢測技術標準化。隨著對cfDNA檢測轉化為臨床應用的更多努力，相信CRC的檢測和治療監測思路會日益豐富，進一步實現個體化醫療和患者利益的提高，為更多的腫瘤患者帶來福音。

節選自：廣東醫學 2019 年 10 月 第 40 卷第 19 期

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