腸道微生物譜的改變與孤獨症譜系障礙的神經遞質代謝活動相關
Altered gut microbial profile is associated with abnormal metabolism activity of Autism Spectrum Disorder
Gut Microbes[7.823]
原文鏈接：https://doi.org/10.1080/19490976.2020.1747329
第一作者：但舟 毛旭華 劉歧莎
通訊作者：劉星吟教授 ([email protected])
主要單位：南京醫科大學基礎醫學院，生殖醫學國家重點實驗室，孤獨症研究中心；江蘇現代病原生物學重點實驗室，南京醫科大學整合腸病學重點實驗室；江蘇大學附屬宜興醫院
標題：腸道微生物譜的改變與孤獨症譜系障礙的異常代謝活動相關
關鍵詞：孤獨症譜系障礙（ASD）、腸道菌群、16S rRNA、宏基因組學、代謝組學、神經遞質
導讀
孤獨症組（ASD）的α多樣性係數隨著年齡的增加無顯著的變化，而健康組（TD）的α多樣性係數同年齡呈正相關，暗示孤獨症患者腸道菌群發育處於相對停滯的狀態。
便秘孤獨症患者組（C-ASD）的物種多樣性降低，源於Sutterella、Prevotella和Bacteroide及同代謝活動紊亂相關的菌群減少，表明這些菌群可能參與便秘孤獨症患者的致病機制。
差異代謝物參與多種神經遞質的代謝，如血清素、多巴胺、組氨酸和γ-氨基丁酸。
差異代謝物與特定物種丰度變化相關。
背景
Introduction
孤獨症譜系障礙（Autism Spectrum Disorder，ASD）是一種廣泛性的發育發展障礙，其病症主要包括異常的行為如社交障礙、刻板動作和狹窄興趣，其中孤獨症（又稱自閉症）為最常見最嚴重的一種。孤獨症的發病率在過去十幾年裡呈上升趨勢，美國兒童患孤獨症的概率為1:59，近幾年，我國孤獨症發病率也逐年攀升，並且在神經類殘疾的疾病中位列第一。
多項研究表明胃腸道功能障礙如脹氣、腹瀉及便秘，在孤獨症患者中較為常見。同時新近研究表明腸道菌群可通過“腸-腦”軸調節胃腸道生理、免疫功能，甚至行為。因此，有必要深入探討不同年齡結構的孤獨症患者的腸道菌群組成及差異。
前期一些小樣本的隊列研究發現孤獨症患者擁有不同的腸道微生物結構，同時早期腸道菌群的組成會影響神經系統的發育，可能導致潛在不良的精神健康和智力活動。此外，一項臨床研究發現孤獨症患者的異常行為同患者年齡和胃腸道症狀相關，因此有必要完善孤獨症患者胃腸道功能異常的臨床診療方法。
慢性便秘是孤獨症患者常見的胃腸道症狀，同時孤獨症患者的便秘症狀同急診室就診、住院次數正相關。因此，有必要深入研究孤獨症患者的腸道菌群組成、菌群代謝物同胃腸道症狀之間的潛在關係。
為了進一步探討孤獨症患者的腸道菌群結構同年齡和代謝之間的關係，以研發出更多診療孤獨症的方法，本研究利用16S rRNA基因測序技術用於評估143例（2-13歲）隊列研究的不同年齡階段的微生物群落，同時利用宏基因組學分析30名便秘孤獨症患者和30名健康者的腸道菌群組成，以探討差異物種同差異代謝物如脂肪酸、氨基酸和神經遞質之間的關係，為孤獨症的診療提供基於腸道菌群的輔助診療方案 。
結果
研究隊列信息
Information of cohort children
本研究採用隊列研究，研究者於2016年5月至2017年8月共招募143名已確診的孤獨症兒童（平均年齡4.937±0.155，男女性別為130:13），命名為ASD組；同時招募了143名隊列健康兒童（平均年齡5.189±0.170，男女性別為127:16），命名為TD組。其中143名孤獨症兒童中有52名具有便秘症狀，5名具有腹瀉症狀（表1）。
表1. 入組研究對象情況表
Table 1. Characteristics of study participants
16S rRNA基因測序結果表明孤獨症兒童的腸道菌群組成發生改變
Alterations of gut microbiota composition in ASD children based on the 16S rRNA data
根據286個樣本的16S rRNA數據的隊列分析，結果表明TD組的OTU數目多於ASD組（圖1A）。α多樣性指數分析表明在門水平上ASD組的豐富度估計量指數顯著低於TD組，而屬水平上無顯著差異（圖1B-1C），同時TD組與ASD組的菌群組成存在顯著差異（圖1D）。在門水平上ASD組的厚壁菌門丰度高於TD組，且厚壁菌門與擬桿菌門比值顯著高於TD組（圖1E）。基於LDA的LEfSe分析發現ASD組的變形菌門Proteobacteria和放線菌門Actinobacteria的相對丰度顯著高於TD組，而擬桿菌門Bacteroidetes顯著降低（圖1F）。在屬水平上，ASD組的Dialister、Escherichia-Shigella和Bifidobacterium丰度較高，而TD組的Prevotella 9、Megamonas和Ruminococcus 2丰度較高（圖1G）。
最近的研究發現兒童神經元發育與腸道菌群相關[1]，因此研究者進一步評估了不同年齡組的菌群多樣性變化。研究者利用三種多樣性指數（豐富度估計量指數、香農指數和系統發育多樣性指數）評估組內年齡相關的α多樣性指數。相對於TD組內的2-3歲亞組，TD組內的7-11歲亞組的α多樣性顯著增加；而ASD組內的α多樣性均無顯著變化，結果表明孤獨者兒童的腸道菌群發育呈現嚴重的滯後狀態（圖1H-1J）。此外，研究者分析了門和屬水平年齡相關的菌群丰度變化（圖1K）。在門水平上，TD組的擬桿菌門同年齡呈負相關，而ASD組卻始終保持在低水平；同時Firmicutes和Cyanobacteria在TD組隨著年齡而增加，而ASD組隨著年齡增加呈現異常變化。在屬水平上，Lachnospira和Megamonas在TD組內的2-3歲和7-11歲亞組中丰度較高，而ASD組不存在此趨勢；Bacteroides在TD組內丰度同年齡負相關，而在ASD組中始終處於低丰度水平。這些結果進一步表明孤獨症兒童神經元的發育可能與特定菌群丰度動態變化的異常相關[2]。
圖1. 16S rRNA測序結果表明健康兒童組（TD）和孤獨症兒童組（ASD）的腸道菌群組成存在差異
Figure 1. The shift of gut microbiota in typically developing (TD) and ASD children according to the 16S rRNA data
（A）OTU數目。（B-C）門水平（B）和屬水平（C）的豐富度估計量指數分析。（D）基於unweighted UniFranc距離的PCoA分析（ANOSIM，R=0.1645，P = 0.001）。（E）厚壁菌門/擬桿菌門比值。（F）兩組差異菌群的LDA評分。（G）LEfSe分析差異菌群，紅色節點表示在ASD組富集，綠色節點表示在TD組富集。（H-J）基於年齡梯度的α多樣性係數分析，包括豐富度估計量指數（H）、香農指數（I）和系統發育多樣性指數（1J）。（K-L）基於年齡梯度在門水平（K）和屬水平（L）的丰度熱圖（秩和檢驗， FDR
< 0.05，FDR < 0.01，*FDR < 0.001）。多項研究表明孤獨症兒童存在腸道問題如腹痛、腹瀉和便秘等。研究者的問卷調查結果也表明近40%孤獨症兒童的腸道存在便秘症狀。為了排除便秘症狀對腸道菌群的影響，研究者利用非便秘孤獨症組（NC-ASD）和TD組進行16S rRNA基因測序分析。結果表明NC-ASD組的OTU數目（圖S1A）和α多樣性指數均減少（圖S1B-S1C），β多樣性存在顯著差異（圖S1D-S1E）。同時，菌群組成也存在差異，相對於TD組而言NC-ASD組和ASD組中的Escherichia-Shigell和norank_f__Lachnospiraceae均顯著升高，而Parabacteroides、[Eubacterium]_eligens_group、Megamonas 和Phascolarctobacterium均顯著降低（圖S1D-S1F）。這些差異菌群在TD組和ASD組中也呈現相同變化趨勢，因此便秘因素可能直接與孤獨症的致病機制相關。同TD組相比，在ASD組中有8個差異菌屬顯著減少，如Dialister、Parasutterella、Christensenellaceae_R-7_group、Coprococcus_2和Collinsella，但是這些菌在NC-ASD組和TD組中均無顯著差異，這暗示著便秘可能促進孤獨症兒童的腸道菌群的異質性發展。
圖S1. 非便秘孤獨症組（NC-ASD）和健康組（TD）的腸道菌群分析。
Figure S1. Gut microbiota analysis between non-constipation of ASD (NC-ASD) and aged-match typically developing (TD)
（A）OTU數目。（B）豐富度估計量指數分析。（C）系統發育多樣性指數分析。（D-E）基於Bray-curtis和unweighted UniFrac的PCoA分析。（F）前30個差異屬的丰度熱圖
為了確定哪些菌群同孤獨症兒童的便秘症狀相關，研究者進一步對便秘孤獨症兒童組（C-ASD）和非便秘孤獨症兒童組（NC-ASD）進行16S rRNA基因測序數據開展隊列分析。結果表明兩組的OTU數目接近（
圖S2A）；同時C-ASD組的α多樣性係數顯著增加（圖S2B-S2C）；兩組的群落結構呈現顯著差異（圖S2D-S2E），如Lachnospiraceae_NK4A136、Subdoligranulum、Ruminococcus、Barnesiella、Butyricicoccus和Ruminiclostridium在NC-ASD組中的相對丰度低於C-ASD組，而Fusobacterium、Acidaminococcus和Veillonella的相對丰度則高於C-ASD組（圖S2F）。因此，該結果表明差異屬菌群可能參與孤獨症患者胃腸道症狀的致病機制。圖S2. 便秘孤獨症組（C-ASD）和非便秘孤獨症組（NC-ASD）的腸道菌群分析。
Figure S2. Gut microbiota analysis between non-constipation of ASD (NC-ASD) and constipation ASD (C-ASD)
（A）OTU數目。（B）豐富度估計量指數分析。（C）系統發育多樣性指數分析 （D-E）基於Bray-curtis和unweighted UniFrac的PCoA分析。（F）前30個差異屬的丰度熱圖。
人類腸道內複雜的微生物生態系統受到不同微生物群體的影響[3]。為了探討腸道微生物群落潛在的共生關係，研究者分析了TD組和ASD組的生態網絡系統，研究發現TD組的屬水平菌群形成了一個相對簡單的生態網絡系統（圖2A），而ASD組呈現了一個在屬水平上共生和拮抗關係都更為複雜的生態網絡系統（圖2B）。因此，以上的分析進一步提示了孤獨症兒童的腸道微生態系統紊亂。
基於腸道菌群的孤獨症疾病預測
Gut microbiota–based prediction of ASD
為了篩選出可作為診斷孤獨症的菌群標記物，研究者基於差異菌屬（相對丰度>0且存在於95%的TD組或ASD組中）利用隨機森林模型，鑑別出24個屬（圖2C-2D）可用於預測孤獨症。
圖2. TD組和ASD組的屬水平腸道菌群結構存在顯著差異
Figure 2. Genera strikingly different across TD and ASD children
（A-B）TD組（A）和ASD組（B）在屬水平上的共生網絡分析。每個節點代表一個屬，節點大小為每個屬在組內的相對丰度，線的粗細為Spearman相關係數，紅線為正相關，綠線為負相關。（C）基於屬水平，利用R隨機森林模型評估屬的鑑別性能，交叉驗證模型根據預測因子數目和重要性進行排序。（D）最具鑑別性的24個屬。水平條形圖的長度代表變量（每個屬菌群）的重要性。顏色代表富集與TD（綠色）或者ASD（紅色）。（E）ROC曲線，AUC（曲線下面積）
宏基因組學揭示了便秘孤獨症兒童和正常兒童在種水平上的腸道菌群結構存在顯著差異
Metagenomic sequencing revealed significant differences between Constipated ASD group and TD group
為了進一步的探討孤獨症與胃腸道症狀之間的潛在相互關係，揭示==孤獨症患者腸道菌群的基因功能及其關聯的代謝通路是與胃腸道症狀是否存在聯繫==，研究者利用宏基因組學技術對30名健康兒童（TD）和30名便秘孤獨症兒童（C-ASD）進行隊列分析。結果表明兩組的基因數目存在差異（圖3A），物種豐富度估計量指數和香農指數均表明C-ASD組的α多樣性顯著降低（圖3B-3C），群落結構也存在顯著差異（圖3D）。秩和檢驗表明C-ASD組的Bacteroides stercoris、Bacteroides plebeius和Bacteroides plebeius CAG:211的相對丰度顯著低於TD組（圖3E）。有趣地是，相對丰度最高的前20個差異物種均在C-ASD組中顯著減少（圖3F），其中包括Bacteroides的9個物種，Prevotella的4個物種，Phascolarctobacterium的2個物種和Paraprevotella xylaniphila。因此，這些差異物種可能參與C-ASD患者的異常胃腸道症狀的發生發展。同時研究者利用Netshift方法篩選出Ruminococcus lactaris可能作為潛在的驅動C-ASD發展的關鍵差異物種（
圖3G）。圖3. 宏基因組學數據表明TD組和便秘ASD組（C-ASD）的腸道微生物組成存在差異
Figure 3. The gut microbiota divergence in ASD with constipation (C-ASD) and TD children based on the Metagenomic sequencing data
（A）微生物的基因數目。（B-C）種水平的α-多樣性指數，包括豐富度估計量指數（B），香農指數（C）。（D）基於Euclidean距離的PCoA分析（ANOSIM，R=0.2262，P = 0.001）。（3E）前35個物種的丰度熱圖。（3F）前20個差異物種的丰度熱圖。箱線圖內部的橫線為中位線， FDR
< 0.05，*FDR < 0.01，秩和檢驗。（3G）利用NetShift網絡工具捕獲TD組和C-ASD組兩個共現網絡中種水平的結構變化。普通的節點在圓的外圍，所有的節點隨機分配不同的顏色，節點大小顯示預測的“驅動微生物”得分，得分大的紅色節點是特別重要的“驅動微生物”；綠色連接線僅出現在TD組，藍色連接線僅出現在ASD組，紅色連接線同時出現在TD組和ASD組。宏基因組學的功能分析揭示便秘孤獨症兒童的腸道功能的受損
Functional analysis of Metagenomic sequencing revealed disrupted bacteria functions in constipated ASD group
宏基因組學可提供微生物相關的基因功能分析。研究者共預測了1550192個微生物基因，ANOSIM分析表明在 KO（KEGG orthologous）水平上TD組和C-ASD組的功能存在顯著差異（圖4A），基因功能組成也存在顯著差異（圖4B）；相對於TD組，ASD組基於level1、level2和ko水平的所有KEGG通路功能發生變化，如能量、脂質、維生素、聚糖和核酸等代謝通路呈降低趨勢（圖4C-4E ）。同時其他的代謝功能如eggNOG，CAZy和ARGs也呈現異常，這些結果為揭示便秘孤獨症患者的腸道功能紊亂的提供了有價值的分子基礎。
圖 4 基於KEGG數據庫對TD組和ASD組的菌群基因功能進行註釋
Figure 4. Microbial gene functions annotation on KEGG in ASD with constipation (C-ASD) and TD children
（A）基於KO水平的差異性分析。（B）基於Bray-curtis的PCoA。（C-D）基於level 1和level 2的KEGG通路的聚類分析。（E）基於KEGG功能的LDA分析評估兩組間差異的代謝通路。
代謝組學分析揭示了孤獨症兒童異常的代謝模式
Metabolomics analysis revealed aberrant metabolic patterns in ASD children
研究表明腸道菌群的代謝產物可進入血液，進一步調控宿主行為及生理活動[2, 4, 5]。因此，研究者採用非靶向代謝組學技術對TD組和C-ASD組進行代謝組學分析並探討其代謝物間的相互作用關係。結果表明TD組和C-ASD組的代謝物組成存在顯著差異（圖5A-5D），同時17個KEGG通路也存在差異，主要表現為全局代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝（圖5E）。其有37個差異代謝物具有2倍的差異，如C-ASD組中的己酸、chloroneb、DL-8-氨基辛酸的相對丰度較高（圖5F）。研究報道氨基酸的中間代謝產物如穀氨酸的2,5-雙氧戊酸酯（2,5-dioxopentanoate）和酪氨酸的去氨基酪氨酸（desaminotyrosine）在孤獨症兒童中含量增加[6, 7]。在本研究中，研究者發現吲哚乙醛（indoleacetaldehyde）和吲哚-3-羧酸（indole-3-carboxylic acid）參與吲哚代謝，它們在兩組中均呈顯著差異。為了研究腸道微生物與代謝產物的關係，研究者利用Spearman相關分析發現相對丰度高的物種如Ruminococcus lactaris、Alistipes spp.、Oscillibacter sp. ER4和Faecalibacterium sp. CAG:74與代謝產物dihydrojasmonic acid、butanone、hexanoic acid、flunitrazepam、fospropofol和caprolactone正相關（圖5G）。
圖5. 便秘孤獨症患者組（C-ASD）和健康組（TD）的腸道菌群存在異常的代謝模式
Figure 5. Aberrant metabolic patterns in ASD with constipation (C-ASD) and typically developing (TD) children
（A， B， C， D） 分別基於正向（ES＋）和負向（ES﹣）的PLS-DA 和 OPLS-DA的PCoA聚類分析。（E）17個差異顯著的KEGG代謝通路。（F）37個差異顯著代謝產物的丰度熱圖。（G）差異代謝產物和前45個物種的關聯分析，選取Fold change≥2，P<0.05>
多項證據表明孤獨症兒童的神經遞質如血清素、多巴胺、GABA和吲哚等表達異常[8, 9]。最近的研究發現腸道菌群參與神經遞質的合成及代謝，因此研究者進一步分析這些差異代謝物是否與神經遞質的代謝相關。結果表明多種代謝物如Dopaquinone、Pyroglutamic acid、N-Carboxyethyl-g-aminobutyric acid、3-Indoxyl-D-Glucopyranoside、Indole-3-carboxylic acid、Valyl-Aspartate、和Caffeoyl aspartic acid參與多種神經遞質的代謝，如血清素、多巴胺、組氨酸和γ-氨基丁酸，同時四氫生物蝶呤（Tetrahydrobiopterin，BH4）的代謝物水平在ASD兒童中表達異常。基於以上的研究結果均揭示
腸道菌群參與神經遞質的合成和代謝途徑。圖6. 便秘孤獨症組（C-ASD）和健康組（TD）差異代謝物富集的KEGG通路
Figure 6. KEGG pathway of the differential metabolites between C-ASD and TD group (Fold change > 1.25, VIP ≥ 1, P < 0.05 T test)
圖7. 孤獨症兒童（ASD）和健康兒童（TD ）腸道菌群組成和代謝分析的概要總結
Figure 7. The summary of gut microbiota composition and metabolism analysis between ASD and TD
結論
本研究揭示了孤獨症患者的腸道菌群在門、屬和種水平上和健康兒童的菌群結構及其代謝的差異。相對於TD組而言，ASD組的腸道菌群組成發生了變化。在ASD組中，Prevotella和Megamonas相對丰度降低，而Escherichia-Shigella、Dialister和Bifidobacterium增加。本研究發現ASD組不同年齡階段兒童的腸道菌群組成與TD組存在差異，
ASD組隨著年齡的增加，其α多樣性沒有變化，而TD組α多樣性隨著年齡增長而增加，這提示ASD組的菌群發育可能處於相對停滯的狀態。同時便秘ASD組（C-ASD）比非便秘ASD組（NC-ASD）的α多樣性增加，該結果提示便秘可能增加孤獨症患者體內腸道菌群的異質性特徵。隨機森林預測模型可高度鑑別ASD組和TD組腸道菌群差異，這為將腸道菌群作為診療ASD提供了可能性。同時ASD組的代謝產物異常，主要表現為脂肪酸、核酸和氨基酸代謝相關，並發現部分腸道菌群的代謝物參與了神經遞質的代謝途徑，這些結果為進一步從腸-微生物-腦軸揭示自閉症的病理機制奠定了基礎。未來通過進一步動物實驗驗證後，發展針對與神經遞質代謝相關的特定微生物群的干預可能是診療孤獨症的一個輔助方案。通訊作者簡介
劉星吟教授，南京醫科大學特聘教授，博士生導師。2006年獲中山大學理學博士學位，2006年~2010年，先後美國羅切斯特大學(University of Rochester)和愛因斯坦醫學院從事腸道微生物和表觀遺傳學研究。2015年10月受聘於南京醫科大學基礎醫學院。並擔任南京醫科大學腸道微生態創新團隊組長。先後入選江蘇特聘教授，江蘇特聘醫學專家。主要從事腸道微生物與人類疾病關聯的研究。近五年，以通訊作者或第一作者在包括Cell Host & Microbe, Cell Reports、PLOS Genetics、Gut Microbes等國際權威期刊發表多篇創新性科研論文。
參考文獻
Warner, B.B., The contribution of the gut microbiome to neurodevelopment and neuropsychiatric disorders. Pediatr Res, 2019. 85(2): p. 216-224.
Zalar, B., A. Haslberger, and B. Peterlin, The Role of Microbiota in Depression - a brief review. Psychiatr Danub, 2018. 30(2): p. 136-141.
Yilmaz, B., et al., Microbial network disturbances in relapsing refractory Crohn’s disease. Nat Med, 2019. 25(2): p. 323-336.
Kuntal, B.K., et al., ‘NetShift’: a methodology for understanding ‘driver microbes’ from healthy and disease microbiome datasets. ISME J, 2019. 13(2): p. 442-454.
Sarkar, A., et al., Psychobiotics and the Manipulation of Bacteria-Gut-Brain Signals. Trends Neurosci, 2016. 39(11): p. 763-781.
Lussu, M., et al., The urinary (1) H-NMR metabolomics profile of an italian autistic children population and their unaffected siblings. Autism Res, 2017. 10(6): p. 1058-1066.
McClintock, M.K., J. Wang, and K. Zhang, Application of Nonphosphorylative Metabolism as an Alternative for Utilization of Lignocellulosic Biomass. Front Microbiol, 2017. 8: p. 2310.
Liu, S., et al., Altered gut microbiota and short chain fatty acids in Chinese children with autism spectrum disorder. Sci Rep, 2019. 9(1): p. 287.
Strandwitz, P., Neurotransmitter modulation by the gut microbiota. Brain Res, 2018. 1693(Pt B): p. 128-133.
10000+：菌群分析 寶寶與貓狗 梅毒狂想曲 提DNA發Nature Cell專刊 腸道指揮大腦
系列教程：微生物組入門 Biostar 微生物組 宏基因組
專業技能：學術圖表 高分文章 生信寶典 不可或缺的人
