1简介
从基础研究到转化医学和诊断学，稀有细胞群体在多个领域中的重要性日益提高。例子包括外周血中的稀有CTC，肿瘤干细胞，循环内皮细胞，造血祖细胞及其亚群以及母体循环中的胎儿细胞。还包括有检测转移性乳腺癌细胞或浸润骨髓的成神经细胞瘤细胞，监测最小残留疾病，检测干细胞和外周血中罕见的HIV感染细胞，抗原特异性T细胞，不变的自然杀伤T细胞（iNKT）以及遗传毒理学中突变频率的分析。也包括多功能测定，例如Ag诱导T淋巴细胞产生不同的细胞因子，增加了在这些T细胞群体中发现稀有细胞的难度。本文围绕稀有细胞讨论，包括所需的样本量，预富集，要使用的标记物数量和要获取的细胞总数，排除双峰的重要性以及使用DUMP通道。
2最优条件
研究稀有细胞需要关注，在所有阶段都应采用优化的最佳方法，包括样品收集，明确定义，合适对照以及强大的软硬件。术语“稀有”通常是指频率为0.01％或以下的事件，尽管 文献中的最稀有记录仍是1000万个外周血细胞中掺入1个肿瘤细胞。需要获取大量事件，高SNR，恰当的阈值，门控和DUMP通道的使用都是最相关的方面。
2.1样本量
根据所研究的稀有细胞的估计频率，计算需要的样本量至关重要。例如，实验的目的是枚举脑脊液（CSF）中存在的稀有细胞群，则考虑到只能从患者身上获得几毫升样本，因此理论上应将采集的所有CSF用于实验。在采集血样时，还需考虑患者的病理状况。例如，研究的终点是在感染HIV的患者中体外刺激iNKT细胞后评估其细胞因子的产生，iNKT细胞在外周PBMC中极为罕见(0.01–1％)。为了定义该群体，使用的标记包括CD3，CD4，CD8，iTCR以及细胞活性标记；感兴趣的细胞因子如TNF-α，IFN-γ，IL-4和IL-17，一共九种。未采取抗逆转录病毒疗法的HIV+患者明显免疫功能低下，CD3+ T淋巴细胞数量少。因此，检测到合理数量的稀有细胞所需的血液样本量（根据Poisson统计）可能多达50 mL，还要考虑分为刺激和未刺激两组进行。
2.2富集和标记的选择
实验终点（例如表型，功能测定）决定是否需要预富集，也需明确鉴定稀有细胞群体的标志物。例如，对循环内皮细胞及其祖细胞的准确定量（如图36所示），至今尚未就用于鉴定这些细胞的标记物或分析前富集（通过密度梯度，血沉棕黄层和/或磁珠富集）的必要性达成共识 。富集有利有弊，可移除大量非目标细胞，但也会丢失细胞包括目标稀有细胞。可能群体鉴定的完整标记物未确定或统一，应该确定最重要的标记物，以初步鉴定和表征这些群体。例如，对于iNKT细胞，Vα24Jα18 iTCR可以唯一识别这些细胞。确定好标记物后，即可按照多色方案配色原则来进行方案设计包括：将最亮的荧光染料用于最弱表达的标记，共表达时Spread影响的考量，补偿管和FMO对照的设置等。
图36. 稀有细胞的门控策略示例。门控策略用于识别外周血白细胞中的循环内皮（CEC）及其前体（EPC）细胞。（A）FSC-A/FSC-H图上去除碎片和聚集体。（B）Time/SSC图上去除不稳定信号包括堵塞。（C）使用DUMP通道去除CD45+和死细胞。（D）基于Syto16+鉴定出有核细胞。（E）根据CD34+鉴定干细胞，（F）鉴定EPC（CD133+，CD31+）和CEC（CD133-，CD31+）。对每个亚群评估了CD276（也称为B7-H3）（G，I）和CD309（H，J）（也称为VEGFR-2或KDR）的表达。此例获取了超过一千万个事件，以分析小于0.1％的稀有群体。
2.3获得的事件数
关于需要获取的事件数量，建议使用泊松统计，它定义了给定数量的事件将在固定的时间/空间间隔内发生的概率，假设这些事件将以已知的平均速率发生，与从先前事件经过的时间无关。对于流式的稀有细胞检测：N为总事件数，R为目标细胞如阳性细胞数，P为目标细胞比例，则为P = R / N，0≤P≤1。方差定义为：Var（R）= NP（1- P）。标准差SD是方差的平方根，CV是等于1/SD即1 /Var的平方根*100%。应用举例，如检测PBMC中的B细胞，健康个体中，CD19+B细胞比例为10％左右，因此：P = 0.1，N=5000时，计算得CV=4.71％，一般建议CV保持在5％以下，因此获得5 000个事件也已足够。若获取10000个总事件，则CV=3.33％。保持达到一定的CV值，目标细胞比例越低，需要获取的总事件数越多。更详细内容请参阅本公众号之前文章“流式实验中泊松分布对稀有细胞检测和分选的启发”。
表6. 0.01％的稀有细胞群体的事件数量示例。
实际还是会发生不能满足CV要求，获取到的目标门内细胞数量非常少的情况，如何判断这群细胞是否真正意义上的目标细胞，Mario Roederer给出了一些建议：若能排除此类阳性事件存在的其他解释如死细胞、碎片引起的噪音或体外靶标激活前体内T细胞活化引起的变化等，则无论事件数量如何，都可以将其视为阳性。因此，没有理由为事件数量确定阈值，在该阈值以下就将其视为阴性结果。当然要求实验设计科学合理，对照科学严谨，结果统计准确。
2.4样品浓度和流速
由于获取大量事件以检测稀有细胞群至关重要，因此样品浓度和流速是关键参数，通常可以缩短采集时间。但是，必须小心，如果流式细胞仪使用流体动力学聚焦（这是目前大多数市售流式细胞仪中使用的系统），则增加流速会导致样本流宽度的增加，从而导致更高的CV。
2.5阈值，门控和DUMP通道
应选择合适参数或组合作为阈值，以有效扣除杂信号保留感兴趣的群体，更详细内容请参阅本公众号之前文章“【基础】阈值”。最大化感兴趣群体的SNR。设门排除死细胞，双峰/聚集体/碎片和所有不需要的细胞群，强烈建议使用“ DUMP”通道包含多个可识别无关细胞的抗体或染料。另使用Time/关注参数的点图消除采集过程中由于堵塞或其他瞬态问题引起的异常事件。仪器应保持清洁，并且必须在采集不同样品之间清洗进样针，以最大程度地减少样品污染和可能的假阳性事件。
3数据分析
最后，数据分析需要足够强大的软件和硬件（8GB RAM或更高），因为所获取的数据文件往往很大，这取决于已获取的事件和参数的数量（例如，在一千万个事件中有10种颜色和2种散射光信号）。为了最小化文件大小，在获取时勾掉不需要的参数，设置恰当的阈值。总之，流式细胞术是目前解决稀有细胞分析的最有效技术，而所谓的“下一代”仪器具有很高的速度和灵敏度，已经使得对这些细胞的检测和分析变得容易。
本公众号另一篇关于稀有细胞的文章搜索可读：【基础】改善稀有细胞检测需要考虑的几种因素。
以上内容若有不妥敬请指正。
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