Cell：抗生素驱动的肠道微生物群紊乱改变了人体对疫苗的免疫反应

原创 yuan 微生态 2019-09-25

导读

新的证据表明微生物群在免疫中起着核心作用。然而，人类试验中这种因果的证据很少。本研究对季节性流感疫苗接种前后的健康成年人使用广谱抗生素。结果显示尽管肠道细菌负荷减少了1万倍，细菌多样性也长期减少，但抗体反应没有受到显著影响。然而在第二次对预先抗体滴度较低的受试者的试验中，抗生素使用对H1N1特异性中和IgG1和IgA结合反应方面存在显著损害。此外，在两项研究中，抗生素治疗均导致(1)炎症信号增强(包括AP-1/NR4A表达)，（以前在老年人中观察到）以及树突状细胞活化增加；(2)代谢轨迹产生差异，以及血清次级胆汁酸减少1000倍，这与AP-1/NR4A信号通路和炎症小体激活高度相关。多组学整合揭示了细菌种类和代谢表型之间的重要联系，强调了微生物组在调节人类免疫中的关键作用。

论文ID

原名：Antibiotics-Driven Gut Microbiome Perturbation Alters Immunity to Vaccines in Humans

期刊：Cell

IF：36.216

发表时间：2019年9月

通讯作者：Bali Pulendran

通讯作者单位：斯坦福大学医学院免疫、移植与感染研究所

实验设计

第一阶段(2015年春季)共纳入22名受试者，随机分为抗生素治疗组(n=11)和对照组(n=11)。第二阶段(2016年春季) 共纳入11名受试者，要求在过去3个流感季节没有接受IIV，且对疫苗中的三种流感毒株中至少两种的MN效价< 320，随机分为抗生素治疗组(n=5)和对照组(n=6)。除一人(无法获得接种前血液样本)外，所有受试者均接种了三价流感疫苗(TIV)。口服抗生素治疗方案包括硫酸新霉素(每天三次，500毫克)，万古霉素(每天四次，125毫克)和甲硝唑(每天三次，500毫克)，共持续5天（接种疫苗前3天至接种后1天）。分别在前21天、前3天、第0天、第1天、第3天、第7天、第30天、第90天、第180天和第365天采集血样和粪便标本(Fig.1A)。

粪便样本进行微生物群基因提取和16S测序，以及生物活性鞭毛蛋白和脂多糖(LPS)定量。新鲜血液分离血浆和外周血单核细胞，分别检测微中和反应、疫苗诱导抗体水平和抗体亲和力（ELISA、Luminex法和表面等离子体共振方法）、转录组、免疫细胞比例（流式细胞术）、代谢组和先天细胞免疫分型。利用MMRN整合转录组学、代谢组学、微生物学和细胞频率信息进行综合分析。

结果

1. 抗生素的使用导致肠道细菌负荷的大幅降低和细菌多样性的持续变化

为探讨人肠道微生物群在接种季节性流感疫苗后形成免疫反应过程中的作用，2014-2015年，研究者共招募了22名18-45岁的健康受试者。随机将其中11名受试者分入5天的广谱抗生素组，包括口服新霉素、万古霉素和甲硝唑混合物，目的是消耗胃肠道中的革兰氏阴性菌(新霉素)、革兰氏阳性菌(新霉素和万古霉素)和厌氧菌(甲硝唑)。抗生素治疗时间为接种疫苗前3天至接种后1天。研究者在免疫接种后1年内定期收集生物样本，并测量免疫系统的关键指标(Fig.1A)。

作者首先分析了对肠道微抗生素生物群的影响。在接种疫苗的当天，抗生素组受试者每克粪便中16S rRNA的拷贝总数减少了103-104倍，拷贝总数是肠道细菌相对丰富程度的替代指标(Fig.1B)。在接种疫苗后的第1天(使用抗生素的最后一天)，抗生素组的总细菌含量达到最低点，然后在第7天到第30天之间逐渐恢复到基线水平。同样地，作者发现粪便中鞭毛蛋白和脂多糖(LPS)浓度也表现出相似的动态变化，即在抗生素给药后的早期显著降低(Fig.1C和Fig.1D)。正如所料，对照组在16S rRNA拷贝数、鞭毛蛋白或LPS浓度随时间的变化上没有显示出明显的变化(Fig.1B-1D)。

考虑到细菌总负荷下降严重，开始探究受影响最大的是哪些细菌种类。细菌科水平分析显示，在使用抗生素后的1个月内，微生物群组成和相对丰度都发生了显著变化。抗生素组的第0、1、3天肠道微生物群主要成分为Enterobacteriaceae，尽管其中两个人似乎可以抵制抗生素干扰，微生物群的总体数量和组成并没有明显改变(Fig.1E)，这可能与抗生素的依从性有关。到第7天，一些受试者的Enterobacteriaceae仍然是升高的，尽管这部分受试者所占比例较低。Streptococcaceae在采样早期也比较丰富，而Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Bacteroidaceae和Veillonellaceae的数量在第0、3天减少。到了第30天，Lachnospiraceae、Enterobacteriaceae和Ruminococcaceae的相对水平仍然受到干扰，但最终在第90天恢复到基线水平(Fig.1E)。

作者还通过样本间β多样性的主坐标分析(PCoA)量化了总体微生物群结构的差异(Fig.1F)。在第0天(接种疫苗的第一天)，抗生素组与对照组的微生物群组成存在明显差异，而第3天两组之间的差距最大。有趣的是，第180天，两组的微生物组成仍然有很大的差异，这表明抗生素组的微生物组成只恢复了原始的一部分。作者还比较了抗生素组使用抗生素前后的微生物群数量和均匀度的α多样性。这两种指标在使用抗生素后都严重受损，其中第3天的OTUs的数量最少(Fig. 1G)。值得注意的是，物种丰富度和生物多样性直到6个月也没有完全恢复，这表明一些独特的细菌种类将长期消失，这与之前的研究一致。

Fig.1 研究概况和抗生素使用对健康成年人肠道微生物群的影响

(A)研究概述。共有22名18-45岁的受试者在第0天接受了三价流感疫苗(TIV)接种。11名受试者随机接受为期5天(接种前3天到接种后1天)的口服广谱抗生素治疗。如图所示，按一定的间隔(黑色圆圈)收集样本进行分析。

(B)每克粪便中细菌16SrRNA的标准化拷贝数。每一行都对应一个受试者。对照组用蓝色表示，抗生素组用红色表示。每个时间点的中值和分布以箱形图的形式表示。

(C和D)每克粪便中鞭毛蛋白(C)和脂多糖(D)的浓度。每条细线代表一个受试者；粗线表示几何平均值。

(E)抗生素组在不同时间点的科水平细菌相对丰度。每个竖条对应一个受试者。在第1天和第3天，数据分别只包含了11个人中的9人和10人。

(F)利用主坐标分析(PCoA)方法，对样品之间微生物组的Bray-Curtis距离降维。每个圆圈对应一个受试者。

(G)α多样性估计。“Observed”多样性表示每个样本中OTUs的数量(丰富度)(左图)。“Shannon”多样性考虑了样本内OTUs的丰富性和均匀性(右图)。在抗生素组中，每个圆圈对应一个受试者。中值和四分位数范围显示在箱形图中。

在计算中，通过Mann-Whitney检验比较了对照组和抗生素组在特定时间点的差异。采用Wilcoxon配对符号秩检验比较同一组不同时间点的差异(G)。*p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001; **** p<0.0001。

2.抗生素对流感疫苗接种所致抗体反应的影响

接下来，作者研究了TIV接种对肠道微生物群的深远持久的影响是如何影响适应性免疫反应的。首先，作者通过测定微中和(MN)反应滴度来评估接种疫苗个体的血清抗体反应。发现对于疫苗中包含的三种流感毒株，这两组人群在所有时间点的MN滴度都相似，这表明抗生素引起的肠道生态系统紊乱并没有显著改变TIV特异性抗体在体外中和同源疫苗毒株的能力(Fig.2A)。对第30天血清转化率(血清转化率为接种后血清中抗体滴度比接种前升高>4倍的受试者占全部受试者的比例)的分析也显示了两组结果具有可比性(Fig.S2A)。但是，作者注意到血清转化率普遍较低，这可能是由于部分受试者的基线滴度较高所致。

为明确抗生素对疫苗所致抗体反应的无影响是否是由于预先存在对流感病毒的免疫力的原因，1年后我们另外招募了11名在疫苗接种前对2015-2016年所用TIV疫苗中包含的三种疫苗株的MN滴度均≤320，并在前三个流感季节没有接种TIV的受试者。随机选择其中5人接受与第1阶段相同的抗生素治疗。第2期抗生素组的5名受试者的肠道微生物群出现了与第1期个体相似的微生物丰富度和多样性下降(Fig.S1A-C)。但是在第2期实验中，发现抗生素组在接种后第90天和第180天H1N1 A/California特异性中和出现异常，而其他两种流感毒株没有观察到任何差异(Fig.2B)。

通过ELISA检验，第2阶段抗生素组受试者第7天，疫苗诱导的针对H1N1 A/California株的IgG1抗体浓度显著降低(Fig.2C，右)。这与第1阶段完全相反，第1阶段IgG1反应的强度没有受到抗生素治疗的强烈影响(Fig.2C，左)。为了确认这一结果，作者请一个独立实验室使用高通量基于Luminex检验方法来验证我们的初步发现。这两项独立的测量结果之间显示出惊人的相关性，Luminex法测定第2阶段抗生素组受试者的H1N1特异性IgG1滴度，发现在接种后第7天和第30天出现显著的损害(Fig.2D和2E)，从而证实了之前的结果。与ELISA数据一致，Luminex法检测1期抗生素组受试者IgG1差异不显著(数据未显示)。重要的是，由于使用抗生素，H1N1 A/California株的抗体亲和力也发生了改变(Fig.2F)。

抗生素治疗对疫苗引起的抗体反应的显著影响并不局限于IgG1。利用表面等离子体共振(SPR)方法检测，作者发现了2期抗生素组接种前后的H1N1特异性IgA抗体反应较低(Fig.2G)。Luminex法再次证实了2期这一差异(Fig.2H和2I)，而在第1期抗生素组未见到IgA抗体差异(Fig.S2D)。

Fig 2抗生素治疗对TIV体液反应的影响

(A和B)第1期(A)和第2期(B)受试者对TIV疫苗中包含的3种流感毒株的MN滴度。几何平均值用粗线表示，几何SDs用阴影表示。

(C) ELISA检测第1期(左)和第2期(右)受试者的与A/California H1结合的IgG1水平。小提琴图显示了样本分布。每个圆圈代表一个单独的受试者，中位数用粗线表示。

(D)高通量Luminex法测定第2期受试者A/California H1的血凝素(HA)特异性IgG1的相对浓度。小提琴图显示了样本分布。每个圆圈代表一个单独的受试者，而中位数用粗线表示。

(E) ELISA和Luminex法分别测定的第0、7和30天的A/California H1的HA特异性IgG1散点图。每个点代表一个受试者。

(F)用表面等离子体共振(SPR)法测量以秒为单位的超率，以评估抗体对A/California H1的亲和力。数据表示为在基线上的往复转换和倍数变化。每一行代表一个受试者。

(G)SPR测量A/California H1的HA特异性IgA亚型结合能力，并表示为第2期受试者的最大共振单元(max RU)。小提琴图显示了样本分布。每个圆圈代表一个单独的受试者，而中位数用粗线表示。

(H) Luminex法测定第2期A/California H1的HA特异性IgA1的相对浓度。每个圆圈代表一个单独的受试者，而中位数用粗线表示。

(I)第0天和第30天，SPR测定的A/California H1的HA特异性IgA亚型结合能力与Luminex测定的A/California H1的HA特异性IgA1的散点图。每个点代表一个受试者。

在计算中，通过Mann-Whitney检验比较了对照组和抗生素治疗组在特定时间点的差异(A-D, F-H)。采用Wilcoxon配对符号秩检验比较同一组不同时间点的差异(F)。(E)和(I)采用Pearson相关。*p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001; **** p<0.0001。

3. 抗生素对疫苗诱导的血液转录反应的影响

为了评估抗生素使用对疫苗诱导的转录反应的量级和动态变化的潜在影响，作者确定了接种疫苗后第1、3、7天(相对于第0天)不同队列中差异表达的基因数量(Fig.3A)。两组反应的动态变化是相同的：疫苗诱导的基因表达变化在第1天达到高峰，然后在第3天下降，第7天第二次增加。与抗生素组相比，对照组在所有时间点上的差异表达基因都有适度的增加，这可能是由于受试者的数量略高(17人对15人)。

然后，作者进行了基因集富集分析(GSEA)，以确定两组中响应TIV的转录通路(Fig.3B)。为此，作者使用了一组血液转录模块(BTMs)，这些模块是作者团队通过大规模网络整合了目前公开可用的人类血液转录组数据集发现的。对照组和接受抗生素治疗的受试者表现出非常相似的富集模式。第一天，与先天免疫反应相关的模块的富集，包括树突状细胞活化、抗原呈递和干扰素信号。第7天，适应性反应的特征出现，细胞周期和浆细胞相关模块的富集反映了浆母细胞的增加。这些观察结果与作者在分析前几个流感季节的健康成人疫苗接种者时确定的激活途径一致。进一步研究了这些典型流感疫苗反应通路中涉及的单个基因的时间分布，发现抗生素使用对干扰素信号转导(Fig.3C)或浆细胞和免疫球蛋白表达(Fig.3D)的动力学或基因表达量没有影响。总的来说，这些发现表明抗生素治疗对流感疫苗的转录反应几乎没有影响。

Fig 3对照组和抗生素组受试者对TIV的转录反应

(A)与第0天相比，接种后第1、3和7天对照组和抗生素组受试者差异表达的基因数量(log2倍改变> 0.2, t检验p < 0.01)。

(B)接种疫苗后，对照组和抗生素组受试者BTMs明显富集(FDR<0.05，标准化富集评分[NES]≥2)。GSEA使用基因列表排序来识别BTMs的阳性(红色)或阴性(绿色)富集，其中基因根据接种后相对于第0天的倍数变化的t统计量排序。

(C和D) M127(C)和M156.1(D)模块内基因在抗生素治疗组(红色)和对照组(蓝色)中的时间表达模式。黑线表示所有基因的平均倍数变化。

4. 抗生素导致血液中促炎性转录和细胞反应

接下来，作者研究了单独使用抗生素是否能引起血液转录组的变化。对抗生素受试者从筛选（前21天）到第0天之间基因表达变化进行了GSEA分析(Fig.4A)。结果发现在使用抗生素后，大量基因模块的表达发生了变化，包括炎症信号的增加和树突状细胞的激活，以及B细胞和细胞周期相关表达的减少。通过流式细胞术测量了几种非特异性免疫细胞的比例，观察到使用抗生素后，CD80+CD16+髓样树突状细胞(mDCs)和CD123+浆细胞样树突状细胞(pDCs)的显著增加(Fig.4B)。这些变化与基因表达检测到的树突状细胞活化富集一致(Fig.4A)。

被抗生素激活的通路中，有几个与AP-1 (FOS/JUN)和Nur (NR4A)转录因子相关的模块尤其令人感兴趣(Fig.4C和4D)。抗生素组受试者在接种疫苗后的第1天，这些模块仍然处于较高水平，而在接种疫苗后的对照组中，这些模块处于较低水平(Fig.4C)。令人惊讶的是，当作者将这些模块的动力学与2010-2011年流感季节接种疫苗的年轻人和老年人的模块进行比较时(分别为淡蓝色和栗色条形图)，可以观察到，年轻受试者与对照组相似（第一天这些模块表达下降）；而抗生素组受试者与老年接种者相似（这些通路在接种疫苗后上调）。这些模块还包括一些使用抗生素后诱导的促炎细胞因子的基因，包括IL6、IL8和CXCL2 (Fig.4D)。为了进一步探索AP-1和NR4A在调节这些转录反应中的潜在作用，作者在TRANSFAC数据库或通过文献检索确定了这些转录因子的潜在靶基因。在第1天观察到这些转录因子和它们各自的靶基因之间有很强的相关性(Fig.4E)。这些结果表明，抗生素驱动的肠道微生物群损耗可能驱动非特异性免疫细胞的炎症信号，其方式与年龄相关的免疫反应变化一致。

Fig.4抗生素使用后的转录组和细胞的应答

(A)抗生素使用后BTMs明显增加(FDR<0.05)。GSEA被用来计算使用排序基因列表的BTMs的标准化富集得分(NES)，按照使用抗生素的受试者第0天和筛选(前21天)的基因倍率变化的t检验值排序。强化的模块根据其高级功能注释着色。

(B)使用抗生素和接种疫苗后树突状细胞亚群的动力学。实线表示平均倍率变化，阴影区域表示95%置信区间。

(C)使用抗生素和接种疫苗后AP-1/ NR4A相关BTMs的动力学。实线代表抗生素治疗组(红色)和对照组(蓝色)的平均模块表达，条形图表示2010-2011年流感季节接种TIV的年轻人(<65岁，淡蓝色)和老年人(≥65岁，栗色)的平均模块表达。误差条表示SEM。

(D) AP-1/ NR4A相关BTMs基因。每条“线”(灰色线)表示一个共表达关系，颜色表示第0天和筛选(前21天)相比的log2倍数表达(正向-红，负向-绿)。

(E)第1天AP-1/NR4A靶基因与相应转录因子的Spearman相关性。AP-1采用FOS/JUN的平均表达量，NR4A家族采用NR4A1/2/3 /3的平均表达量计算相关关系。

在计算中，通过Student’ s t检验比较控制组和抗生素治疗组在特定时间点的差异。*p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001; **** p<0.0001。

5. 抗生素会扰乱血液代谢组

众所周知，肠道微生物群在各种营养物质的代谢过程中发挥着重要作用，包括消化复杂碳水化合物和合成维生素。因此，作者试图通过非靶向高分辨率代谢组学检测使用抗生素后受试者血液代谢组学的变化。相对于对照组，抗生素组受试者的代谢组确实出现了较大的波动，这是通过计算筛选（前21天）和第0天两个时间点之间最可变代谢物特征的欧氏距离来衡量的(Fig.5A)。利用mummichog软件对差异特征进行富集分析，

接下来，作者研究了肠道微生物群消耗对流感疫苗后的代谢反应的影响。在对照组中，对疫苗接种反应的代谢变化在第1天达到高峰(Fig.5D)。抗生素组在第一天也有类似程度的反应；但是，他们的代谢物组变化远远超过了对照组，并在接种疫苗后的第7天仍然表现出与第0天相比相当大的差异。当作者检查接种疫苗后增强了的代谢途径时，发现两组之间增强的代谢途径几乎没有重叠(Fig.5E)。因此，抗生素确实显著改变了血液中流感疫苗接种后的代谢反应。

为了进一步探讨代谢反应的差异，作者对两组存在丰度差异的代谢物峰在不同时间点的倍数变化值(p<0.01)进行主成分分析(PCA)。与对照组相比，抗生素组受试者在接种疫苗前后的代谢轨迹都发生了深刻的变化(Fig.5F)。重要的是，两名抗生素治疗的受试者的轨迹与对照组相同，他们的微生物群几乎没有变化(Fig 1)，这表明他们对抗生素方案的依从性较差。

Fig.5 抗生素和流感疫苗对血液代谢组的影响

(A)对照组(蓝色)和抗生素组(红色)第0天和筛选(前21天)的最多变(所有时间点间变异系数>8%)代谢物特征的欧氏距离。误差条表示SEM。

(B)抗生素使用后代谢通路明显丰富。Mummichog软件被用来确定抗生素组受试者第0天与筛选(前21天)时间点间基于表达差异代谢物特征(p<0.05，Student’s t检验)的强化通路 (p<0.05，置换检验)。

(C)相对于筛选(前21天)，第0-7天接受抗生素治疗受试者的初级和次级胆汁酸的倍数变化。

(D)相对于第0天，接种疫苗后第1-7天对照组和抗生素组受试者之间最可变(所有时间点间变异系数>8%)代谢物特征的欧氏距离。误差条表示SEM。

(E) 对照组受试者和接受抗生素治疗受试者接种流感疫苗后，代谢通路显著增加(p<0.05)。

(F)相对于筛选时间(前21天)，第0-7天对照组和抗生素组受试者前两种主要成分的代谢轨迹。这里代谢轨迹是指在研究过程中(0-7天)，根据在主成分空间中投射的所有不同代谢物特征的丰度变化(p<0.01)的每个受试者的代谢轨迹。

在计算中，通过Student’s t检验比较控制组和抗生素治疗组在特定时间点的差异。*p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001; **** p<0.0001。

6.抗生素组受试者的次级胆汁酸紊乱与NLRP3炎症小体信号转导升高有关

考虑到肠内微生物群的损失严重改变了血浆代谢组，作者希望探索这种代谢紊乱与观察到的抗生素治疗后细胞和转录变化之间的潜在联系(Fig.4)。在抗生素组受试者中，胆汁酸代谢发生了显著改变，这种代谢紊乱与炎症性肠病(IBDs)有关，并可能在这种情况下发挥免疫调节作用。事实上，对转录组和代谢组学数据的综合分析显示，单个次级胆汁酸水平与图4中所示的许多炎症性BTMs呈显著的负相关，这些BTMs是抗生素治疗后诱导产生的(Fig.6A)。抗生素治疗后，血浆中石胆酸(LCA)减少了1000倍(Fig.6E)。LCA与炎症反应的相关性最强，包括参与AP-1信号传导的模块(如M35.0)；M35.0在抗生素组受试者疫苗接种后上调(Fig.6C)，而在对照组接种后下调(Fig.6D)。LCA是胆汁酸受体TGR5最有效的激动剂，TGR5信号已被证明可以抑制小鼠NLRP3炎症小体的激活。此外，AP-1在IL–1B介导的促炎细胞因子(如IL-6)诱导中发挥重要作用。因此，作者还研究了炎性小体和IL-1B信号通路相关基因的表达变化，并发现了其与LCA和其他次级胆汁酸的密切联系(Fig.6A和6B)。这些发现强调了一种潜在的机制，微生物群可以通过这种机制调节人类的炎症反应。

Fig.6抗生素组受试者次级胆汁酸紊乱与NLRP3炎症小体信号转导升高有关

(A)Circos图显示了抗生素组和对照组相对于筛查时间(前21天)，第0-7天继发性胆汁酸、抗生素诱导的BTMs (Fig 4A)和炎性小体信号基因的log2倍变化。直线表示显著相关(p<0.01，所有时间点的Pearson相关)。

(B) FOSB表达随血浆中LCA倍数变化的散点图(各时间点)。每个点代表一个受试者。

(C和D)抗生素组(C)和对照组(D)中，M35.0基因的倍数变化。每一个“线”(灰色线)表示共表达式关系; 颜色代表第一天与筛查时间(前21天)的log2倍变化(正向, 黄色; 负向, 蓝色)。

(E)抗生素组(红色)和对照组(蓝色)血浆中LCA的变化。每条细线代表一个受试者; 粗线表示几何平均值。

7. MMRN分析表明肠道微生物群通过不同的途径调节炎症信号传导和抗体对疫苗的应答

肠道微生物群可以通过将微生物刺激物易位到体腔内直接影响免疫反应，也可以通过次生信使(如代谢物)间接影响免疫反应。因此，作者测量了血清中鞭毛蛋白和抗LPS抗体的浓度(Fig.S1D-F)，但在对照组和抗生素组间没有发现任何差异，这反驳了微生物刺激物向体腔内转移的假设。为探讨假设中的间接影响，作者构建了一个多尺度、多因素的反应网络(MMRN)，它综合了转录、代谢、微生物和细胞分析，以确定抗生素使用和流感疫苗接种期间这些数据类型之间的关系。在该网络中，

接下来，为确定与观察到的胆汁酸代谢和H1N1特异性IgG1响应的差异最相关的网络节点，作者通过一种基于富集的方法对该网络进行了查询，使用的特征是根据其第0天与筛选时间的倍数变化的相关性进行排序，这些变化要么与抗生素导致的LCA变化有关，要么与第30天H1N1特异性IgG1丰度有关(Fig.7B)。与作者之前的分析一致，LCA降低和转录簇G3增加之间存在显著负相关，转录簇G3包含许多参与炎症反应、树突状细胞活化和AP-1信号的BTMs。此外，LCA还与富含胆汁酸生物合成的代谢物簇M79密切相关，这表明非靶向代谢组学分析能够准确地捕捉到微生物群紊乱所改变的代谢通路。

尽管在抗生素组受试者的胆汁酸代谢和IgG1反应都受到了干扰，但与LCA和H1N1特异性IgG1丰度都相关的代谢和转录簇几乎是没有重叠的。只有富含雄激素和雌激素代谢的代谢产物簇M84与这两个参数都负相关。与这种低重叠一致，IgG1滴度与胆汁酸丰度变化呈弱相关。相反地，普遍相关的特征都是由细菌主导的，有三个细菌簇与这两个参数都呈正相关。对这些细菌簇的组成分析表明，Lachnospiraceae和Ruminococcaceae科成员的比例很高(Fig.7C)，并均在抗生素治疗后显著降低(Fig.7D)。有趣的是，在与IgG1反应单独相关的集群中，有两个富含脂肪酸代谢的集群(M26和M58)，这两个集群正逐渐成为免疫功能的关键调控因子。

细菌群在网络中的中心作用促使研究者进一步研究肠道细菌含量对这两种途径的重要性。事实上，LCA的变化与抗生素治疗后的粪便中的细菌负荷、鞭毛蛋白和LPS含量密切相关(Fig 7D)，H1N1特异性IgG1丰度也与中鞭毛蛋白的减少显著相关(Fig 7E)。有趣的是，鞭毛蛋白和IgG1效价之间的这种正相关只在基线效价较低的2期受试者中显著，这突出了免疫记忆对严重失调的恢复能力。综上所述，这些结果表明，次级胆汁酸相关的炎症信号和流感疫苗IgG1应答受损是由抗生素驱动的肠道关键菌群丢失所介导的独立效应。

Fig.7 MMRN分析表明，肠道微生物群在调节炎症信号和H1N1特异性IgG1方面具有独特的功能反应

(A)MMRN中包含的不同数据类型之间p值的分布。

(B)第0天vs筛选，MMRN连接中的可视化网络子集，包含与LCA或H1N1特异性IgG1相关的节点。每个节点都是来自一个数据类型的特性集群。通过偏最小二乘回归和置换检验的显著相关(FDR <0.05)建立节点间的联系(灰色)。通过基于富集的方法对网络中抗生素诱导的节点变化(第0天vs筛选)和LCA(第0天vs筛选)与H1G1特异性IgG1(第0天vs第30天)的关联进行查询，以确定积极(红色)或消极(绿色)关联(FDR<0.05; NES> 2.6)。

(C)饼状图显示了细菌群B0、B1和B4中的OTUs目成员。

(D)第0天vs筛查，血浆LCA水平与细菌负荷(16S rRNA qPCR检测)、LPS，鞭毛蛋白的倍数变化的散点图。每个点代表一个受试者。

(E)粪便鞭毛蛋白丰度的第0天与筛选间变化倍数分别与第7天和第30天HIN1特异性IgG1的散点图。每个点代表一个受试者。

讨论

通过在两个具有不同中和性抗体基线水平的独立队列中进行这项试验，研究者能够深入了解预先存在的体液免疫对微生物群介导的疫苗接种适应性反应变化的影响。基线滴度高的受试者抗生素对疫苗所致抗体反应的影响最小，但在基线滴度低的第二期受试者中，作者观察到接种疫苗后，抗生素治疗对H1N1特异性IgG1的数量有显著影响。值得注意的是，这种效果只在对H1N1的反应中观察到，并没有在其他菌株中出现。其原因目前尚不清楚，但成人接种疫苗后H3N2和B抗体的反应可能主要是依靠回忆性记忆反应。最近的研究表明，由于之前接种疫苗或感染，成年人的H3N2和B亚型记忆水平较高。

这些结果为研究者之前在小鼠模型的发现提供了重要的背景：在小鼠中，通过敲除TLR5或使用抗生素，TLR5介导的鞭毛蛋白传感缺失导致流感疫苗接种后抗体滴度显著降低。实验小鼠对流感病毒的应答是首次的，而实际上所有人都曾接触过流感，而且与最初的反应相比，涉及回忆反应的机制可能对肠道微生物群的变化更具恢复力。这些结果突出了人类免疫系统的真正适应性，它似乎能够在很大程度上保持对刺激或挑战的适当反应，尽管由于微生物群波动而引起了显著的生理失调。这也强调了在形成免疫系统中免疫记忆和环境的重要性。以往的研究表明，人群内的免疫变异主要是由环境因素(如先前的免疫暴露)而不是遗传因素驱动的。本研究的结果与成年人免疫反应的概念一致，即免疫反应主要由免疫史决定，并且对微生物群的短暂变化具有弹性。然而，在未来将这类分析扩展到婴儿群体将是极其重要的。在婴儿群体中，免疫系统的不成熟状态可能更容易受到这种干扰，而不受免疫印迹的影响。有关自身免疫性疾病(如哮喘和1型糖尿病)与分娩方法相关的肠道微生物差异的报道已经证明了这一点。

关于先天免疫反应，作者观察到仅使用抗生素就能在免疫系统内引起显著的细胞和转录变化，促进促炎状态。综合分析显示，这些炎症反应与细菌介导的次级胆汁酸生成减少密切相关。次级胆汁酸(如LCA)除了通过TGR5抑制NLRP3炎性小体，还通过与维生素D受体和孕烷X受体结合抑制促炎细胞因子的产生和核因子kB (NF-kB)靶蛋白的表达。综上所述，这些结果表明抗生素治疗后在外周血中检测到的炎症反应是由肠道菌群对胆汁酸代谢破坏导致的炎症小体增加所驱动的。

有趣的是，抗生素引起的促炎状态与老年人对流感疫苗的早期转录反应相似。已知微生物组的组成随年龄而变化，表现为厚壁菌门和整体多样性减少。与年龄相关的微生物群变化对胆酸代谢的影响尚未得到很好的证实，但有证据表明老年受试者的肠道微生物群产生其他免疫调节代谢产物的能力较低，如短链脂肪酸。小鼠实验显示这些上调的通路(AP-1和NR4A信号)也被认为是由细菌LPS触发的，并且肠道通透性会随着年龄的增长而增加。进一步研究肠道微生物群影响老年人免疫系统的直接和间接机制，将有助于了解微生物群中与年龄相关的变化如何有助于慢性炎症和免疫衰老。

最后，研究者构建了一个MMRN，它综合了多种数据类型对抗生素治疗和流感疫苗接种的反应。研究结果表明，微生物组是通过其他的机制调节胆汁酸代谢及其对炎症的影响，而不通过影响抗体反应。有趣的是，IgG1反应与脂肪酸代谢高度富集的两个代谢簇显著相关，而脂肪酸代谢是免疫反应的重要调控因子。这些结果强调了微生物群对免疫功能发挥多种作用的能力，不仅是通过与肠道内的免疫细胞直接相互作用，还通过如调节关键代谢物的系统可用性等间接机制。

在此，作者已经证明了由抗生素驱动的微生物群波动可能影响健康成年人对疫苗的免疫反应。由于抗生素和疫苗是最广泛使用的两种医疗干预手段，这对临床实践和公共卫生具有重要意义。这些发现将为进一步的研究提供信息，以更好地理解肠道微生物群和免疫系统之间相互作用的机制。

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