最近，新型冠狀病毒疫情一直揪著全國人民的心。從各地分離出毒株開始，到完成測序比對之後，普通民眾最關心的是我們的藥物和疫苗還要多久才能面世？科研界也在全力投入進行病毒感染機制研究，以期早日“知其然知其所以然”，實現精準防治。
冠狀病毒刺突糖蛋白（Spike）和受體ACE2是嚴重急性呼吸道綜合症（SARS-CoV）的關鍵結合位點。由於新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）和SARS-CoV的基因序列以及發病狀態等方面的相似性，使得科研界再一次將目光投向冠狀病毒刺突糖蛋白（Spike）和受體ACE2的研究。對Spike蛋白和宿主受體蛋白的結合位點分析意義重大，可以讓我們更清楚的瞭解該病毒的入侵方式，受體的作用機制，為當前的新冠病毒入侵提供策略，為以後可能發生的冠狀病毒的防治鋪開道路。
冠狀病毒刺突糖蛋白（CoV Spike）蛋白結構域分析
第一個要講的是冠狀病毒的Spike蛋白（S）。冠狀病毒的S蛋白分為S1和S2結構域。S蛋白介導受體與病毒蛋白膜之間的融合方式通常是這樣的：
•S1負責與受體結合。S1結構域的N末端與C末端均可與宿主受體結合。
•S2負責與宿主細胞膜融合。冠狀病毒S2含有多個關鍵分子，包括多個融合肽和兩個保守肽重複序列（HRs），來驅動病毒與宿主細胞之間的融合。HRs可以三聚成捲曲結構，將病毒包膜和宿主細胞雙層緊密靠近，為融合的發生做準備。
圖1. CoV Spike蛋白結構示意圖
儘管SARS-CoV-2和SARS-CoV屬於不同種的菌株，但它們在用於鑑別的S1保守域中仍有約50個保守氨基酸保持一致，這說明SARS-CoV-2和SARS-CoV的結構相似，且二者同屬於β冠狀病毒，而β冠狀病毒的受體結合域通常位於S1的C末端，如圖2所示。由此我們可以猜測，SARS-CoV-2的宿主受體是否和SARS-CoV的宿主受體相同？
圖2. 系統發育分析和SARS-CoV-2，SARS-CoV和MERS-CoV的受體結合域（引自Roujian Lu 2020）
圖A. 各種β冠狀病毒的受體結合結構域的系統發育分析。
圖B、C、D：SARS-CoV，SARS-CoV-2和MERS-CoV結合其宿主受體結構域的比較。核心結構用品紅表示，SARS-CoV，SARS-CoV-2和MERS CoV的外部子域分別是橙色，深藍色和綠色。受體結合位點中SARS-CoV和SARS-CoV-2之間的可變殘基突出顯示為棒狀。圖C SARS-CoV-2，❓表示新型冠狀病毒使用的受體仍然未知。(自2020年2月11日國際病毒分會為新冠病毒提供新的命名之後，本文均用SARS-CoV-2代替2019-nCoV。)
研究發現，SARS-CoV要進入受體，首先要通過病毒RBD（receptor binding domain）與細胞表面受體ACE2結合。那麼SARS-CoV-2的S蛋白與人ACE2受體是否具有親和性呢？根據前期研究發現，使用HeLa細胞表達的ACE2可以作為SARS-CoV-2的受體，但是如何結合還有待進一步研究。下面我們就來淺談一下ACE2蛋白的結構。
ACE2受體蛋白結構分析
ACE2是一種I型跨膜糖蛋白，包含一個由兩個α螺旋構成的N端胞外域。病毒受體結合域RBD利用其外部結構域與受體的N末端結合。如圖3所示。RBD凹表面有424-494殘基，也稱為受體結合基序（Receptor binding motif RBM），形成ACE2的N端螺旋與受體進行接觸，所組成的複合物形成SARS-CoV RBD 927.8A˚2和ACE2 884.7A˚2的界面，該界面包含受體中的至少18個殘基和RBD中的14個殘基，形成了一個在RBD/ACE2相互作用中占主導地位的親水性接觸網絡。在與ACE2結合後，SARS-CoV包膜與宿主細胞膜之間的融合由S2亞基完成。
圖3. SARS-CoV及其受體ACE2結構示意圖 （參考Guangwen Lu 2015）
綠色：RBD核心；品紅：RBD核外域；青色：ACE2 N末端；橙色：ACE2 C末端
SARS-CoV-2與SARS-CoV二者的序列具有79%的相似性，同時我們發現SARS-CoV-2 RBD序列，包括其RBM直接接觸ACE2的途徑也與SARS-CoV相似，於是研究者就猜測ACE2受體很可能是SARS-CoV-2感染人體的關鍵受體蛋白。
如圖4所示，與SARS-CoV相比，SARS-CoV-2 受體結合基序（RBM）除了在遠離ACE2結合區環上插入了一個殘基之外不包含任何刪除和插入序列。
圖4. SARS-CoV和SARS-CoV-2對ACE2識別的結構分析(參考Yushun Wan 2020)
A. 實驗確定SARS-CoV RBD和人類ACE2之間的界面結構，SARS-CoV RBD上的五個殘基均經過自然選擇，並顯示出對ACE2的識別以及進入宿主細胞至關重要。
B. SARS-CoV-2 RBD與人ACE2之間的界面建模結構。根據SARS-CoV與SARS-CoV-2之間的序列關聯，對應出相應的殘基編號。
在與ACE2接觸的病毒受體結合域的14個殘基中，SARS-CoV-2和SARS-CoV中有9個是完全保守的，有4個是部分保守的，下面我們就來分析這些殘基。
SARS-CoV病毒受體結合域中的殘基479位於人ACE2上的病毒結合位點Lys31（即hotspot-31）附近。Hotspot-31由埋在疏水環境中的Lys31和Glu35之間的鹽橋組成。K479N突變消除了RBD與人類ACE2界面的不利作用，增強了病毒與ACE2的結合，並使SARS-CoV從人到人的傳播中發揮了關鍵作用。重要的是，SARS-CoV-2 RBD中的Gln493與hotspot-31兼容，這表明SARS-CoV-2能夠識別人ACE2並感染人類細胞。
而SARS-CoV-2 RBD中的501殘基（對應於SARS-CoV中的487殘基）是天冬醯胺。根據研究者之前的結構分析，
SARS-CoV中的487殘基位於人ACE2上的病毒結合位點Lys353（即hotspot-353）附近。 Hotspot-353由Lys353和Asp38之間的鹽橋組成，該鹽橋也被埋在疏水環境中。在2002年分離出的人SARS-CoV中，487殘基是蘇氨酸，可增強353號熱點的結構穩定性。S487T突變增加了RBD 與人類ACE2界面的相互作用，增強了病毒與人類ACE2的結合，並在人與人之間傳播SARS-CoV的過程中發揮了關鍵作用。
455、486和494殘基在SARS-CoV-2 RBD中分別為亮氨酸，苯丙氨酸和絲氨酸，分別對應於SARS-CoV中的442、472和480殘基。研究者發現，SARS-CoV RBD中的這三個殘基在ACE2結合中起著重要作用，儘管不如殘基479和487劇烈。
儘管存在氨基酸殘基的替換，但SARS-CoV-2的S蛋白與人ACE2受體仍然具有顯著的結合親和力。也就是說，hotspot-31和hotspot-353或許就是我們要研究的重要位點。但是由於小鼠或大鼠ACE2的353位含有一個組氨酸，它並不像賴氨酸那樣適合病毒與受體之間的相互作用，這對於中間宿主的篩選也提供了一項證明。
表1. 不同物種ACE2與SARS-CoV RBD的結合（引用Fang Li 2016）
與SARS-CoV和MERS-CoV一樣，SARS-CoV-2也是人畜共患病原體，可越過物種間的壁壘感染人類。病毒種間傳播的機制是一個亟需解決的重要科學問題。這些冠狀病毒的胞膜蛋白和受體識別併發生細胞融合，而Spike蛋白在與膜發生融合之前需要被宿主蛋白切割，這個過程也是病毒在感染宿主時的必經過程，因此，若是將其阻斷，即可阻止了病毒的感染性。
結語
本文詳細表述了Spike蛋白和細胞膜受體蛋白ACE2的結構以及作用方式，結合之前關於SARS-CoV的相關研究對SARS-CoV-2進行分析，最終落腳到受體蛋白上的兩個結合熱點區，然而要驗證這些位點與臨床表現的關係，必須回到體內進行研究，以基因修飾小鼠模型為研究工具，進行更精細化更貼近臨床的研究，這或許對疫苗及藥物的研發有著重要的指導意義。當然，這裡沒有探討同樣是冠狀病毒的MERS-CoV結合域及其受體CD26，如果感興趣，我們期待著能給研究者們帶來更多的精彩解讀。
病毒研究道阻且長，希望在人類與微生物的抗戰中，我們能走在前面，站在高處，更透徹的瞭解對手，人類文明因為有科學技術的不斷探索而變得更加神秘而多彩。
參考文獻：
1. Roujian Lu, Xiang Zhao, Juan Li, Peihua Niu, Bo Yang, Honglong Wu et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. The lancet. 2020.
2. Guangwen Lu, Qihui Wang, George F. Gao. Bat-to-human: spike features determing host jump of coronaviruses SARS-CoV, MERS-CoV, and beyond. Cell press. 2015.
3. Fang Li. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annual review of virology. 2016.
4. Yushun Wan, Jian Shang et al. Receptor recognition by novel coronavirus from Wuhan: An analysis based on decade-long structural studies of SARS. Journal of virology. 2020.
5. Fang Li et al. Structure of SARS coronavirus spike receptor-binding domain complexed with receptor. Science. 2016.
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