circRNA敲降（干擾）
在研究circRNA功能的方法中，最經典的抑制circRNA的方法是通過RNAi的方式（shRNA）進行敲降。為了避免影響到mRNA，設計方案時需將干擾序列設計在反向剪接位點（BSS）處。 源井生物通過設計高效的shRNA，用慢病毒法將干擾載體轉入細胞中，根據最佳藥篩濃度對細胞進行藥物篩選，直到對照組細胞全部死亡，獲得circRNA敲降的穩定細胞株。
應用案例：
用siRNA進行敲降後，通過檢測細胞增殖凋亡情況，說明circ-HIPK3敲除後抑制細胞增殖。首先設計三組實驗，分別針對HIPK3 mRNA線性轉錄本、circ-HIPK3環狀轉錄本和兩種轉錄本共有部分設計siRNA，並在HEK-293 T細胞繫上驗證設計的siRNA只干擾相應的轉錄本。
利用增殖凋亡檢測試劑盒：CCK-8和EdU進行細胞增殖凋亡檢測，結果顯示HIPK3 mRNA敲降後不明顯影響細胞增殖，而circ-HIPK3敲降後，會明顯抑制細胞增殖。
參考文獻：
Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.
circRNA過表達
circRNA過表達一直有成環效率低，容易錯配成環等難點。通過優化側翼成環框架，如成環元件、QKI等RBP的結合位點，使circRNA準確高效環化。過表達後仍需要檢測是否成功成環，以及線性mRNA是否表達。為了研究一種新環狀RNA載體表達系統的成環效率，選擇小鼠circRtn4環狀基因在多種細胞系（包括Hela，N2a，HEK293）中進行表達驗證。根據不同細胞系中進行的RT-QPCR實驗數據顯示，新載體系統pCircRNA-DMo-Rtn4成環效率在幾種不同的細胞系中均比普通的載體系統（pCircRNA-BE-Rtn4）要高效得多。
circRNA的檢測與鑑定
Northern Blotting是檢測circRNA的金標準，探針通常跨反向剪接位點設計。但由於Northern Blotting需要的circRNA量非常大，耗時間精力，而且探針一般是放射性標記，操作上比較困難。常用的檢測方案還是用RT-PCR或者是RT-QPCR，引物設計在反向剪接位點兩端。
來源 | 源井生物
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