原創 仰望星空 微生態 2019-12-25
導讀
微生物群正變得越來越重要，因為人類健康和疾病之間的平衡可以通過腸道菌群來調節。腸道菌群可以局部和系統地調控宿主的免疫系統。腫瘤免疫治療已經成為治療腫瘤患者的一種有效方法。越來越多的證據支持微生物群影響癌症免疫治療的療效，特別是免疫檢查點抑制劑，如阻斷PD-1或PD-L1和CTLA-4等免疫檢查點抑制劑（ICIS）。在這裡，我們討論腸道菌群，腫瘤，免疫和腫瘤免疫治療之間的相互關係，重點是免疫治療。此外，我們還簡要介紹影響治療效果的相關挑戰，並提出了可能的解決辦法。
論文ID
原名：Gut microbiome and cancer immunotherapy
期刊：Cancer Letters
IF：6.508
發表時間：2019.04
作者單位：華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院
主要內容
人類微生物生態系統在人類健康和疾病中起著重要作用。人類微生物群由各種微生物組成，如細菌、真菌、古細菌、原生動物和病毒等，它們存在於我們身體的上皮屏障表面。腸道微生物群中含有約3×1013種細菌，其中大部分與宿主共生。微生物群可影響多種生理功能，特別是代謝、炎症和免疫。當腸道微生態系統發生變化時，一些共生細菌可以迅速增殖並獲得致病特徵，包括艱難梭菌或萬古黴素耐藥腸球菌。腸道菌群與上皮細胞和基質細胞相互作用，發揮各種重要的調節功能。例如，它可以調節屏障功能，維持粘膜免疫穩態和宿主微生物共生，防止病原體感染，控制病理生物的過度生長，調節代謝，包括維生素合成和不可消化膳食纖維的代謝。因此，健康的身體離不開具有特定功能的完整腸上皮，腸道菌群、免疫細胞和粘膜屏障共同維持腸上皮的穩態。
腫瘤免疫治療已成為治療腫瘤患者的一種新興方式。它利用免疫系統發揮抗腫瘤的作用。免疫檢查點抑制劑（ICIS）作為一種新型的免疫治療藥物，在晚期血液惡性腫瘤中取得了很好的臨床治療效果，單克隆抗體（mAbs）阻斷細胞毒性T淋巴細胞抗原-4（CTLA-4）和程序性細胞死亡蛋白1/程序性細胞死亡1配體1（PD-1/PD-L1）。然而，有一些患者在治療過程中出現了原發性或獲得性耐藥，阻礙了ICIS的廣泛臨床應用。鑑於此，選擇最佳的候選患者是避免耐藥性和提高ICIS療效的關鍵。此外，許多關於克服免疫治療的耐藥的相關研究也正在進行中。
越來越多的文獻報道腸道菌群在腫瘤治療中發揮重要作用。腸道微生物成分對外周免疫系統有深刻的影響，包括在腫瘤相關的免疫。最近的研究表明，腸道菌群影響ICIS對腫瘤的治療效果。值得注意的是，腸道菌群的破壞（被稱為“腸道菌群失調”）一直在流行病學上與各種慢性炎症疾病有關。在此，我們討論了腸道菌群、腫瘤、免疫和腫瘤免疫療法之間的關係，重點是免疫療法。同時，我們簡要介紹了影響免疫治療的療效的相關挑戰，並提出了可能的解決方案。
1 微生物群與腫瘤
所有與宿主相關的微生物都是在出生後通過垂直傳播獲得的，然後通過整個生命中的環境暴露而繼續進化。腸道菌群在天然免疫和獲得性免疫反應中起著至關重要的作用。腸道菌群可以實現調控炎症、感染、食物和共生抗原耐受之間的微妙平衡。除了對局部免疫生理學的影響外，腸道菌群在整個有機體中起著全身性的作用。例如，與野生自由生存的動物相比，在特定無病原體(SPF)條件下飼養的實驗小鼠缺乏促進宿主健康的關鍵特性。鑑於此，通過將野生型小鼠腸道菌群轉移到實驗小鼠身上，可以產生長時間的免疫調節作用，即使經過幾代繁殖，這種效應仍然存在。因此，它有利於抗病毒感染以及致突變和炎症引起的癌變。
已經發現，微生物群與上皮屏障和無菌組織中多種腫瘤類型的發生和發展密切相關。微生物棲息在腸道或其他粘膜中，在局部和遠處癌變過程中發揮作用：
①一方面，微生物群可以作為腫瘤轉化劑直接提供有毒代謝物或致癌產品。
②另一方面，它通過誘導炎症或免疫抑制而間接地在促進癌症中發揮作用。
③此外，通過糞菌移植(FMT)，可以將無免疫相關基因(如Tbx 21、Nod2、Nlrp6或TLR5)的基因敲除小鼠的“容易發生腫瘤”的特點轉移到其他正常小鼠中。
④同時，也有越來越多的證據表明，細菌通過增強宿主的抗腫瘤免疫力，在對抗遠離腸道的腫瘤也發揮著積極的作用。
相關研究也表明抗生素的使用與癌症風險之間存在劑量依賴關係。此外，對於無菌小鼠(GF)和無特異性免疫增強細菌物種的小鼠以及使用了廣譜抗生素的小鼠，抗腫瘤治療的效果都有所減弱。治療效果有限是由於腸道菌群的缺失或菌群的調控所致。菌群提高抗腫瘤免疫應答的精細機制可根據治療方式而變化。例如，環磷酰胺導致小腸的易位-在結腸中存在著腸球菌，並在結腸中積累了巴氏桿菌，這兩者都有助於在抗腫瘤免疫中發揮協調的免疫刺激。這歸因於上端胃腸道的滲透性增加。為了證實這些實驗結果，在轉移性肺、腎和膀胱癌患者隊列中進行獨立回顧性分析顯示，抗生素在靶向PD1/PD-L1的單抗治療中發揮了“有害作用”。
此外，腸道細菌在血液學惡性腫瘤中調節了異基因造血幹細胞移植（ASCT）後感染和移植物抗宿主病（GVHD）的風險。早期應用全身廣譜抗生素與GVHD和移植相關死亡率的增加相關，可能是在腸道菌群中保護性Clostridiales andBlautia菌的耗竭有關。總之，所有這些研究都為識別具有抗癌活性的“好菌”提供了依據。
2 腸道結構、微生物群和免疫
人類體內存在著數以萬億計的微生物。在發育過程中，微生物在身體的許多部位，如皮膚和粘膜表面，不斷地與宿主相互作用(圖1)。因此，可以想象微生物在宿主功能中發揮著各種極其重要的作用，包括免疫功能。
腸粘膜包括由腸上皮細胞(IECs)和上皮內淋巴細胞組成的單上皮細胞層(圖1)。這種獨特的結構促進了與免疫系統的相互作用。Paneth細胞和杯狀細胞分別位於IECs中，分泌抗微生物肽和粘液，進一步覆蓋上皮。固有層是位於粘膜層下面的結締組織層，並且含有Peyer‘s斑和各種免疫細胞，例如抗原呈遞細胞(APCs)、先天淋巴細胞、T和B細胞。腸相關淋巴組織是體內免疫系統的最大組成部分的典型代表，在局部和全身免疫反應中起重要作用。
模式識別受體介導的病原體相關分子模式識別(PAMPs)促進了局部免疫。模式識別受體(PRRs)包括IECs上的Toll樣受體(TLRs)和腸道內的天然免疫效應器，而PAMPs則含有脂多糖和鞭毛素。此外，局部免疫反應可能受到細菌產生的代謝產物的影響，主要是通過產生短鏈脂肪酸(SCFAs)。已經證明，SCFAs在許多關鍵的活動中可以通過漿細胞產生IgA來增強免疫。IgA不僅通過阻斷細菌與上皮細胞的粘附作用，而且還直接影響細菌的毒力。
腸的引流淋巴結位於小腸和結腸的腸繫膜中，稱為腸繫膜淋巴結(mLNs)。在mLNs內，共生菌轉化獲得性免疫應答，然後影響幼稚T細胞的分化。PAMPs用於誘導包括樹突細胞(DCs)的APCs的成熟。當DCs成熟時，它們進入mLNs並與幼稚T細胞通信並進一步促進幼稚T細胞發育成CD4+T細胞，特別是CD4+調節性T細胞(Tregs)和T輔助性T細胞17(Th17)，兩者都具有腸道趨向性。活化的T細胞在腸內穩態中起關鍵作用，如由Tregs誘導的粘膜耐受性和免疫抑制細胞因子的產生(例如IL-10)。值得注意的是，腸道共生菌和粘膜T細胞(例如Tregs)之間會發生相互作用，因為細菌代謝產物例如SCFAs促進這些細胞在腸道水平的維持 。SCFAs的功能依賴於它們抑制組蛋白去丙酮酶活性的能力，表明存在表觀遺傳學相關的調節。或者，Tregs的發育是通過依賴多糖A和TLR信號到DC的途徑介導。作為CD4+細胞的定義的子集的Th17細胞在腸固有層中很關鍵，它在預防病原體感染方面發揮著重要作用。由於Th17細胞分泌的細胞因子，包括IL-17，誘導IECs形成緊密的連接並分泌抗菌肽；Th17細胞也在黏膜免疫中起作用。IL-17還可進一步導致其它炎性細胞因子的釋放。此外，中性粒細胞可以從血液循環中募集到腸道微環境中。在GF小鼠中，Th17細胞顯著缺乏，但可由稱為分段絲狀細菌的特定細菌亞群（segmentedfilamentous bacteria）所誘導。
此外，系統性免疫應答可以通過微生物群介導的免疫細胞誘導來形成。當DCs呈遞來自共生細菌的抗原到腸的mLNs以及B細胞和T細胞時，包括Tregs和Th17細胞，可在整個身體中行進，並通過與類似表位的交叉反應促進針對遠處相同抗原的免疫應答或對抗其它抗原。顯然，Th17細胞在功能上是具有可塑性的，因為它們可以基於局部炎性或非炎症條件改變它們的細胞因子的釋放。
微生態平衡，稱為生態平衡，對維持免疫具有重要意義。豐富多樣的微生物群可以提高嬰兒對各種疫苗的適應性免疫反應。特定的微生物組分通過激活TLR信號途徑作為天然疫苗佐劑也可引發免疫應答。相反，生態失調會導致腸道菌群的平衡破壞。它具有以下特點：
微生物群的多樣性減少和相對不穩定，以及機會性病原體的潛在積累。當然，菌群失調會帶來一系列的改變，例如，破壞粘膜屏障，並損害局部和全身免疫應答，腸道細菌轉移至mLNs並進入外周循環。腸粘膜和mLNs中的細胞因子環境改變成傾向於炎症的表型，激活Th17細胞和效應T細胞，最終，局部和全身都會引起明顯的炎症狀態。簡言之，腸道菌群對局部和全身的免疫系統都產生了深刻的影響。此外，免疫系統也可以在不同的水平改變腸道菌群。
圖1 腸道結構、微生物群和免疫
腸菌群對宿主的局部和全身的都免疫系統有深遠的影響。腸粘膜包括由腸上皮細胞(IECs)和上皮內淋巴細胞組成的單層上皮細胞。Paneth細胞和杯狀細胞分別位於IECs中，分泌抗微生物肽和粘液。細菌代謝產物（如SCFAs）或細菌本身可激活局部DCs遷移至腸繫膜淋巴結（mLNs）。成熟的DCs進一步激活幼稚T細胞以分化成效應T細胞、Tregs或Th17細胞，其可以遷移回到腸粘膜或全身循環中。對於局部免疫反應，Tregs分泌IL-10並作用以產生局部抗炎細胞因子環境。來自Th17細胞的細胞因子分泌包括IL-17誘導IECs形成緊密連接並分泌抗菌肽，IL-17可進一步導致其它炎性細胞因子的釋放。對於全身免疫反應，可通過菌群介導的免疫細胞引發來塑造。當DCs呈遞來自共生細菌的抗原到腸的mLNs以及B細胞和T細胞時，包括Tregs和Th17細胞，可在整個身體中行進，並通過與類似表位的交叉反應促進針對遠處相同抗原的免疫應答或對抗其它抗原。
如上所述，腸道菌群在免疫中起著不可替代的作用。同樣，微生物在腫瘤免疫治療中也起著重要的作用，尤其是ICIS。最初在小鼠模型中發現腸道菌群可以調節免疫檢查點阻斷的反應。目前，越來越多的證據表明腸道菌群可能在調節免疫治療的反應中起著關鍵作用。其中，許多發現已在接受免疫治療的患者中得到證實，如ICIs。
首先，免疫檢查點抑制劑抗PD-1/PD-L1或抗CTLA-4的應答可能受腸道菌群成分的影響。對於PD-1/PD-L1的阻斷，不同微生物對治療的反應有顯著性差異。腸道菌群分析表明，腫瘤生長緩慢的小鼠體內雙歧桿菌種類明顯增多，抗PD-1治療有明顯的改善作用。有較好微生物的小鼠，可通過FMT或同窩飼養轉移到其他小鼠身上。此外，對腸道菌群不利的小鼠通過口服含有雙歧桿菌的益生菌，從而提高了PD-L1阻斷的抗腫瘤作用。這種作用主要來自於DC成熟的增強，從而提高了腫瘤特異性CD8+ T細胞的活性。經抗CTLA-4處理後，小鼠腸道菌群豐富度數量發生明顯變化，主要表現為Bacteroidales和Burkholderiales的相對增加以及Clostridiales的減少。口服Bacteroidesfragilis菌劑同時使用用環磷酰胺(Taiotaomicron)或頭孢菌素(Burkholderia Cepacian)可觸發Th1反應，促進DC成熟，從而提高抗CTLA-4的療效。而在使用廣譜抗生素的GF小鼠和SPF小鼠中，抗CTLA-4的作用明顯減弱，這種作用可通過FMT逆轉患者的優勢菌群。
此外，腸道菌群在免疫檢查點阻斷治療的患者中發揮著重要作用，這是臨床轉化的基礎。最近的研究證實了腸道菌群的重要性。在抗PD1/PD-L1治療過程中，未使用抗生素治療的上皮腫瘤患者的總生存率和無進展生存率明顯高於接受抗生素治療的腫瘤患者。 這種現象表明，使用抗生素可能會破壞腸道菌群，從而損害抗腫瘤免疫和對免疫檢查點阻斷的反應。這些患者的糞便樣本通過宏基因組測序顯示，對PD1阻斷有反應的患者的腸道細菌組成不同，存在豐富的Akkermansia和Alistipes菌。在抗PD1治療前，通過在GF小鼠中使用來自應答患者(R)的糞便樣本實施FMT，發現其免疫力增強，而接受FMt的GF小鼠的免疫可以單獨使用Akkermansia muciniphila或聯合使用E.hirae來恢復。有趣的是，A. muciniphilia與免疫細胞癌灶中的的浸潤相關，隨著CR9+CXCR3+CD4+T細胞被募集到癌灶中，CD4+T細胞與CD4+FoxP3+ T細胞Ttregs)的比率增加。在轉移性黑色素瘤患者中，抗PD1治療的療效也受腸道菌群的影響。對PD-1治療有反應的患者的腸道菌群的多樣性顯著增加，某些微生物比較豐富，如Clostridiales，Ruminococcaceae和Faecalibacterium。然而，對於無反應的患者，他們的腸道細菌多樣性較低和具有更高的Bacteroidales菌丰度。對腸道菌群成分的分析和腫瘤微環境中的免疫譜分析表明，與腸道菌群不利的患者相比，具有良好腸道菌群的患者細胞毒性T細胞標記物和抗原處理和呈遞的表達增強。另一項研究還表明，腸道菌群的差異發生在對ICIs的反應。特別是對PD-1阻斷有反應的患者富含Bifidobacteriumlongum, Collinsella aerofaciens和 Enterococcus faecium。將應答者糞便樣本轉移到GF小鼠也成功地複製了優勢表型：與接受無應答者糞便的小鼠相比，腫瘤生長較慢，治療效果較好。上述結果是通過增加CD8+T細胞和減少腫瘤微環境中的Tregs來實現的。
對免疫檢查點阻斷劑反應差異的分析可能與幾個不同的因素密切相關，例如分析樣本的技術和所參考的數據庫的差異。其他因素包括地理、飲食和生活方式，也可能是觀察到的一些差異的原因。
然而，腸道菌群也會對免疫檢查點阻斷造成毒性。動物模型和臨床隊列研究了腸道菌群對毒性的影響。使用抗CTLA-4治療的黑色素瘤患者中富含Bacteroidetes菌和各種遺傳途徑，涉及多胺轉運和B維生素的合成，並未發生結腸炎。這種毒性可能與這些細菌的已知效應有關。其他研究還顯示，在抗CTLA-4治療後，在具有較高丰度的Faecalibacteriumprausnitzii菌和較低丰度的Bacteroides菌患者中存在較高的結腸炎風險。與反應和毒性有關的細菌具有不同的分類群，其中一些具有重疊的特徵。根據相關研究，在ICIs中，參與反應和毒性的細菌分類群包含在硬壁菌門的Ruminococaceae科內。相反，缺乏對ICIs反應的細菌分類群包含在Bacteroidete門的Bacteroidales目中，但這些分類中的較高丰度通常會降低毒性的發生率。
總之，不可否認的是腸道菌群影響免疫治療的治療效果。腸道菌群既可以調節抗腫瘤免疫應答，又能調節對免疫檢查點抑制劑的應答。
4 改善腫瘤治療中的腸道菌群的挑戰及對策
儘管腸道菌群有望用於腫瘤治療，特別是免疫治療，但仍有一些挑戰需要解決。
首先，腸道內有害細菌的存在會對免疫治療的效果產生負面影響。目前，抗生素可用於清除有害細菌，但也可能造成某些風險，包括由於缺乏特異性而導致的菌群失調。益生菌，包括飲食或化學物質，應該促進特定細菌的定植和相對擴張，這可能對抗腫瘤免疫產生有益的影響。在這方面，膳食纖維的成分可以被代謝產生具有免疫調節特性的短鏈脂肪酸，相關的研究已經證實了這一點。然而，益生菌的作用取決於宿主中已經存在的特定細菌。因此，益生素和特定細菌的結合，稱為共生體，可能是有前景的。值得注意的是，在食品工業中，由於噬菌體對特定細菌的高選擇性，噬菌體已被應用於消除有害細菌。
此外，儘管FMT在治療難治性艱難梭菌腹瀉方面取得了令人鼓舞的結果，但FMT需要考慮幾個關鍵因素，特別是選擇最佳的供體 。理想情況下，FMT供體應該是具有多種微生物成分的個體，包括有利的細菌。到目前為止，Bifidobacteria spp. , Akkermansiamuciniphilia, E.hirae, and Bacteroides spp已被認為是“好細菌”，能有效地提高機體抗腫瘤免疫能力，更好地控制腫瘤在體內的生長。值得注意的是，病原體的轉移也是一個潛在的問題，無論細菌、病毒或寄生蟲等等都需要仔細檢查。一些細菌似乎在炎症引起的癌變中起作用。將結直腸癌患者的腸道微生物群轉移到GF小鼠體內，可引起不典型增生、息肉形成和腫瘤發生，這在正常供體移植過程中是不可能發生的。此外，從特定供體中轉移共生細菌的一個理想選擇是單獨或聯合使用特定的細菌。該策略將涉及三個方面：
①將提高宿主抗腫瘤免疫的準確的細菌進行分離，
②支持其體外擴增的培養條件，
③最後是保持生物活性的包裝方法。
現有的測序方法可以優先檢測最豐富的細菌，並有良好的臨床效果，而忽略了較低數量的細菌。然而，這些細菌在功能上也很重要。因此，對珍稀微生物進行仔細的分離、培養和機制測試是值得考慮的。
此外，不同研究小組確定的細菌種類在癌症治療中可能不一致。由N.Chaput等人研究發現B. fragilis在轉移性黑色素瘤中所佔比例較低，且Bacteroidales菌比例較高，阻礙了抗CTLA-4對轉移性黑色素瘤患者的抗腫瘤作用。然而，Marie Véizou等人發現較高的B. fragilis比率有助於腫瘤消退。此外，N.Chaput等人研究觀察到硬壁門菌，比如Faecalibacterium菌、產丁酸桿菌和G. formicilis與較高的應答率、更長的無進展存活率(PFS)和總存活率(OS)有關。此外，該小組注意到抗生素的使用並不影響主要微生物和細菌種類的組成，但可能影響療效。這一現象與以前的研究不一致，因為抗生素的使用損害了ICIs的療效，值得進一步研究。
有幾個方面可以解釋不同研究之間的差異：
① 偏好容易發生在FMT中，小鼠模型和人類模型之間存在差異限制了結論的外推。例如，通過移植腫瘤細胞在小鼠體內建立的腫瘤可能不能準確地反映人體對治療的反應。
② 與實際的腫瘤微環境相比，異種移植模型缺乏多步驟致癌和慢性炎症的過程；
③ 在小鼠體內注射腫瘤細胞通常伴隨著腫瘤細胞的死亡，從而產生最初的免疫效果。
④ 在小鼠實驗中，由於qPCR分析某些細菌種類的侷限性，很難排除其它細菌的干擾。
值得注意的是，除了治療性結腸炎患者外，抗CTLA-4並沒有引起腸道菌群成分的顯著變化，這與Marie Vézou等人得出的結論相反。有趣的是，Mao K等人最近的一項研究注意到先天和適應性免疫反應影響腸道微生物群的狀態。因此，可以想象釋放的T細胞會重塑腸道菌群，例如某些細菌數量和比例的改變，甚至細菌形態和功能的變化。因此，今後應進行大量的研究以評估ICIs對腸道菌群的影響。
此外，應該強調的是不同研究之間存在差異。這些差異可能包括三個方面：
① 具有不同遺傳和營養模式的患者，
② 在歐洲或美國不同地理位置進行的臨床試驗，
③ 以及黑色素瘤、肺癌和腎細胞癌等腫瘤類型。
鑑於這些方面，人們發現，通常與健康有關的細菌(例如，Ruminococcacae,Akkermansiamuciniphila,和 Bifidobacteria)或免疫原性(例如Enterococci,Collinsella和 Alistipes)可能在對腫瘤有反應的病人中富集。對541例血液病患者的研究表明，診斷時腸道菌群影響異基因造血幹細胞移植(ASCT)後2年內復發的可能性。值得注意的是，主要由Eubacterium limosum組成大量的細菌群對預後有積極的影響。
其他因素也可以調節腸道菌群，包括飲食、睡眠週期、運動和藥物等。因此，這些參數都可能與免疫檢查點抑制劑和其它免疫治療的療效有關。
圖2 改善腫瘤治療中的腸道菌群的挑戰及對策
a. 腸道中的不利細菌會對免疫治療的效果產生負面影響。為了解決這一問題，抗生素可以用來清除有害細菌，但由於缺乏特異性，可能會帶來諸如失調等危險。益生菌，包括飲食或化學物質，可以促進特定細菌的定植和相對擴繁，這可能對抗腫瘤免疫產生有益的影響。此外，益生素和特定細菌的結合，稱為共生體，可能是有前景的。
b. 選擇最佳的FMT供體是提高抗腫瘤免疫的關鍵。目前，一些細菌，包括Bifidobacteriaspp. , Akkermansia muciniphilia, E.hirae, and Bacteroides spp已被認為是一種“好細菌”，能有效地提高機體抗腫瘤免疫能力，更好地控制腫瘤在體內的生長。然而，病原體的轉移是一個潛在的陷阱，需要清除致病菌。此外，現有的測序方法可能優先檢測最豐富的細菌，具有良好的臨床效果，而忽略了較低數量的細菌。因此，對珍稀微生物進行仔細的分離、培養和機制測試是值得考慮的。
c. 其他因素，包括飲食、睡眠週期、運動和藥物，可以調節腸道微生物的組成，我們可以通過調控這些因素來增強抗腫瘤免疫力。
評論
微生態的時代已經悄然來臨，關於微生物在癌症中作用的臨床前和臨床研究的開拓性報道使得腸道菌群成為一種很有前途的癌症治療策略。我們已經觀察到腸道菌群對腫瘤和免疫的影響，然而，其潛在的機制還不太清楚。此外，在如何調節腸道微生物群以提高腫瘤免疫治療的效果方面，仍有一些挑戰有待解決。目前尚不清楚腸道菌群的哪一種特殊成分最有利於促進抗腫瘤免疫的反應，並且有多種改菌群的治療方法，這需要在臨床試驗中進行仔細的測試。只有充分理解這些相互作用，我們才能學會如何優化調節腸道菌群，以增強宿主的抗腫瘤免疫能力，並有可能改善免疫監視。
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