抗擊瘧疾的血淚史
近200年來，隨著流行病學和免疫學的進步，在疫苗的幫助下，大部分致命傳染病（像天花）要麼被消滅，要麼被嚴密控制。相比之下，瘧疾這個困擾人類健康數千年的惡魔卻依然肆虐非常。瘧疾多難戰勝？早在公元5世紀，強盛的羅馬帝國儘管鐵蹄踏遍歐亞大陸，而一場突如其來的瘧疾就能每天奪去數千人的生命，最終一半居民死於此病。再看如今，據世界衛生組織（WHO）上個月剛剛發佈的《2018年世界瘧疾報告》，2017年全世界共發生約2.19億例瘧疾，其中約435,000例死亡，死者中超過61%都是5歲以下兒童！與之相比，2010年發病人數是2.37億，2015年是2.11億。[1] 人類與瘧疾之戰依舊處於膠著狀態，難言獲勝。在與瘧疾的鬥爭中，許多英雄橫空出世，例如Ronald Ross、Charles Louis Alphonse Laveran、Paul Hermann Müller和屠呦呦教授分別獲得1902、1907、1948和2015年諾貝爾獎，另外有機合成大師Woodward也因為抗瘧疾藥金雞納生物鹼的不對稱合成開創了立體選擇性有機合成先河。
瘧疾發病率分佈圖。圖片來源：WHO [2]
中醫“治未病”思想與瘧疾的防治策略
瘧疾難以消除的根本原因是瘧原蟲容易產生抗藥性。比如1960年時，氯喹和磺胺類抗瘧疾藥（阻斷葉酸合成進而影響DNA複製）的治癒率接近95%以上，但是幾年後降至20%。而我們熟知的一線抗瘧疾神藥——青蒿素及其衍生物，近年來也發現其治療效率逐步下降 [3]。目前治療瘧疾的策略陷入了尷尬的循環：發病後治療 → 瘧原蟲進化出抗藥性或復發 → 再開發新藥或新的藥物組合 → 再次產生抗藥性或復發……這就好比我們追著瘧原蟲尾巴跑，打到一種，還有更多跳出來。此外，瘧疾也很難預防。目前還沒有非常可靠的瘧疾疫苗問世，WHO推薦的“殺蟲劑處理過的蚊帳”和“病媒控制”這兩大措施還無法做到萬無一失。
瘧原蟲如此難纏，主要與它們複雜的生活史有關。瘧原蟲的宿主有兩個——人類和按蚊，生活史分三個階段：紅細胞外期（exo-erythrocytic cycle），子孢子（sporozoite）感染人類肝細胞並獲取營養產生裂殖子（merozoite），這段時間沒有任何症狀，也很難檢測；紅細胞內期（erythrocytic cycle），除進行裂體增殖外，部分裂殖子侵入紅細胞後形成配子體（gametocyte），這一時期紅細胞被大量破壞，產生症狀；子孢子期（sporogonic cycle），含有配子體的血液被蚊子吸取，配子體在蚊胃中發育成熟進行配子生殖，最後產生子孢子進入蚊子的唾液腺，有機會再次感染人體。目前的抗瘧疾藥物主要打擊紅細胞內期的瘧原蟲，雖這一部分被消滅，但肝細胞內的瘧原蟲還在悄悄潛伏，它們還可能繼續進行裂體增殖，從而再次侵入紅細胞使瘧疾復發。而且，這個時期瘧原蟲數量不過數百，而紅細胞內期則暴增至數十億，如此強大的增殖能力給瘧原蟲進化出抗藥性提供了充分的保障。因此，
紅細胞外期的存在是瘧疾復發和產生抗藥性的根源。 瘧原蟲生活史：A. 紅細胞外期；B. 紅細胞內期；C. 子孢子期。圖片來源：CDC [4]
很自然的，科學家想到在沒有症狀的紅細胞外期進行干預，既可以阻止瘧疾進展又可以克服耐藥性問題，起到類似疫苗的預防作用。這就和中醫“治未病”的理論不謀而合。然而，這種樸素的思想在瘧疾上卻一直很難實現，開發特異性殺滅肝細胞中子孢子的藥物進展艱難。一個重要的原因在於，驗證化合物抑制子孢子活性的體外實驗很難進行。子孢子至今都無法在實驗室內進行無汙染培養，科學家只能先在實驗室產生被配子體感染的蚊子，隨後人工解剖蚊子，分離出被孢子體感染的唾液腺。
2016年，美國加州大學聖地亞哥分校（UCSD）Stephan Meister和Elizabeth A. Winzeler等研究者終於發明了一種方法來高通量篩選可殺滅肝細胞中子孢子的藥物。[5] 他們隨後依靠這個方法，花費大量精力篩選出新的預防性抗瘧疾藥物和新的作用靶點，結果發表在頂級期刊Science 上。
這篇Science，真心不容易
我們先從他們發明的高通量篩選方法說起。這種體外篩選模型的建立和初步篩選，數字背後都有實驗人員的“血和淚”：
歷時2年，每週解剖約1,000只被感染的蚊子，從總數近百萬個蚊子唾液腺中分離表達熒光素的瘧原蟲Plasmodium berghei 的子孢子（代表紅細胞外期的肝細胞感染階段），鋪在已用過化合物處理的人肝癌細胞HepG2上，如果瘧原蟲成功感染HepG2（即使僅1%），在熒光素存在下就會發出熒光，儀器便能讀出光強度，光強度與感染率成一定比例，由此判斷感染比例。幸運的是，這種熒光測試可以通過1536孔板來進行。
隨後，他們歷時
18個月，將Charles River化合物庫（分子量60-1298 Da，基本滿足Lipinski五規則）的538,273個小分子進行高通量篩選（平均每週篩約20,000個，因為有些需要重複實驗，當然產生細胞毒的也要排除）。經過三輪篩選（每輪標準不同）留下半數抑制濃度IC50小於1 μM的631個化合物待靶點驗證。值得一提的是，這次發現的不少化合物骨架，在此前並沒有報道可用於瘧疾的預防和治療。
通過代謝組學分析，發現13種代表化合物（Tanimoto相似性很小，說明這些化合物和之前報道的抗瘧疾藥結構類型差別較大）中10個與線粒體電子轉移鏈（mETC）有關。利用轉基因的高表達二氫乳清酸脫氫酶（DHODH）的瘧原蟲，這些化合物的EC50變化很大（24-1000倍），表明作用於DHODH。此外，研究者認為還有化合物可能具有先前未知的作用機制。
小結
科學家通過使用可評估化合物對紅細胞外期階段瘧原蟲抑制活性的高通量體外篩選實驗，歷時兩年從上百萬只蚊子和數十萬化合物庫中篩選出一系列具有新穎骨架的抗瘧疾苗頭化合物，並驗證其作用於線粒體呼吸鏈靶點DHODH，有望大大促進預防和治療瘧疾的藥物的開發。但不得不說，從苗頭化合物到最終的上市藥物，科學家們還有更多困難要克服。衷心希望有一天，能夠開發出優秀的“化合物疫苗”，將瘧疾這一頑疾扼殺在作惡之前。
原文
Open-source discovery of chemical leads for next-generation chemoprotective antimalarials
Science, 2018, DOI: 10.1126/science.aat9446
參考文獻：
1.https://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2018/en/
2.http://www.who.int/gho/malaria/en/
3. B. Blasco et al., Antimalarial drug resistance: Linking Plasmodium falciparum parasite biology to the clinic. Nat. Med., 2017, 23, 917-928.
4.https://www.cdc.gov/malaria/about/biology/
5. J. Swann et al., High-throughput luciferase-based assay for the discovery of therapeutics that prevent malaria. ACS Infect. Dis., 2016, 2, 281–293
（本文由西北望供稿）
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