我们简单介绍了一下E2N的味道，及其在啤酒中出现的化学通路。今天我们就来详细的了解这个过程。
E2N不是一种成品啤酒的“氧化味”
首先，我们来澄清一个错误的观点。
各种科普资料经常含糊地表达纸板味的来源，例如：啤酒在储藏过程中由于啤酒里的溶解氧和未排干净的空气导致啤酒老化，出现纸板味…… 然而实质上，在1999年的一份论文就指出：啤酒储藏中产生的E2N与氧气没有关联。
该论文使用一种很暴力的方法，就是往新鲜啤酒通入96ppm的同位素氧气（氧-18），然后观察强制老化（在40摄氏度下存放5日）及自然老化（室温下存放3个月）后，E2N的增长。
Nonoxidative Mechanism for Development of Trans-2-Nonenal in Beer
从上面的表格我们可以看出无论注入氧-18与否，与E2N的增加并没有关联（Relative）。换言之，在成品啤酒中，氧气的含量与E2N的增加并无关系。
E2N产生机理
E2N在制麦和糖化都有可能会产生。其中的机理大致相同。
让我们追根溯源。
在全面研究啤酒的E2N之前，科学家就已经了解到脂质最终会被氧化为各种醛类。最早研究脂质与E2N的关系，来自于各种瓜果蔬菜，黄瓜、甜瓜、香蕉等等。他们了解到这些瓜果的味道是一些醛类物质的表现，尤其是在被切开（或者碾碎）后产生的气味更为明显，这个可能与植物自身防卫机制有关，出于自卫而散发出一些令其他生物抗拒的味道。
在一系列研究后，科学家们得知黄瓜（Cucumis sativus）脂质降解为E2N的过程，中间经历了几个步骤，其中包括酶促氧化、酶促裂合及酶促异构。其步骤如下：
- 脂质被脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）水解为亚油酸。
- 亚油酸在脂氧合酶的催化下降解为一些氢过氧化合物，主要是13-HOPD及9-HPOD。
- 这些化合物在对应的裂合酶（Lyase）作用下被切割成各种烯醛（Enal），己烯醛，顺-3-壬烯醛（Cis-3-noneal）等。
- 其中顺-3-壬烯醛被烯醛异构酶（Enal Isomerase）异构后得到E2N。
来源：The formation of cis-3-nonenal, trans-2-nonenal and hexanal from linoleic acid hydroperoxide isomers by a hydroperoxide cleavage enzyme system in cucumber (Cucumis sativus) fruits.
而在大麦的反应中有着与上图几乎相同的途径。
The chemistry of beer aging – a critical review
在此解释一下图里的几种化合物，亚油酸是一种双不饱和脂肪酸，大量存在与各种植物中，我们常用的花生油就包含了32%的亚油酸。
9-LOOH以及13-LOOH，即9-HPOD及13-HPOD。9-HPOD（(10E,12z)-9-hydroperoxyoctadeca-10,12-dienoic acid，(10E,12Z)-9-氢过氧基十八碳-10,12-二烯酸），是一种亚油酸的代谢物，同样广泛存在于各种生物中。
而所谓的9-HPL like Activity（9-hydroperoxide lyase-like activity），很有可能是9-HPL（9-hydroperoxide lyase，9-氢过氧裂合酶）与烯醛异构酶的共同反应结果。这个将会在下面讲到。
LOX-1
想要从根源性解决问题，就必须从生物的代谢通路入手，下面将解释在通路中遇到的酶和相关的反应。
尽管降解途径看起来与黄瓜的代谢很相似，但不同的生物体的酶尽管功能（也就是基因表达）一样，但基因组成却不尽一样。在大麦里的脂氧合酶是LOX1_HORVU。其中HORVU是指大麦的学名Hordeum vulgare的缩写。部分文献又有HvLox-1的称谓，Hv指的也是学名的缩写。为方便表达，本文还是沿用LOX-1。
LOX-1是一种较为常规的酶，热敏（即高温可以灭活），高活性pH范围为5-8.5。它的主要反应底物（Substrate，指能够催化的化合物）就是亚油酸盐（Linoleate），通过氧促反应代谢为9-HPOD。反应式如下：
<code>Linoleate + O(2) <=> (9S,10E,12Z)-9-hydroperoxy-10,12-octadecadienoate /<code>
在路径图里值得注意的是，产物13-HPOD和9-HPOD都是脂氧合酶的同工酶（对应LOX-1，LOX-2）的产物，但是两种同工酶的作用不一样，导致了结果不一样，所以后期的试验中，主要以研究如何减少LOX-1为主。
9-HPL
除了讨论脂氧合酶外，在生成E2N之前还有两个两个重要的步骤，裂合与异构。裂合是9-HPOD降解为醛类的必经步骤。其中为了裂合9-HPOD，有种专门针对它的裂合酶——9-HPL。
9-HPL属于细胞色素P450这个超家族（Super Family，基因超家族，指由同一个基因复制及变异得来的一大组基因），在这个超家族里它称为CYP74C。与CYP74A、CYP74B不一样的是，9-HPL带有HPL基因，所以可以裂合氢过氧化合物。
大米（Oryza sativa）中 9-HPL对于 9-HPOD的切割及其切割位置 来源：Metacyc
研究表明，不同植物的9-HPL对于9-HPOD和13-HPOD有着不同的活性，像西瓜就两样都有相同活性，但番石榴的9-HPL就只对9-HPOD有活性。
烯醛异构酶
目前只是假设可能有异构酶的存在。05年，Hisao Kuroda（来自札幌啤酒厂价值创造先锋实验室）检测到在整个9-氢过氧剪切酶样反应，产物从Z3N（3Z-nonenal，即cis-3-nonenal，顺-3-壬烯醛）到E2N的过程。其中，Z代表着顺式（cis），E代表着反式（trans）。
顺式结构的化合物转变为反式结构的化合物，一般需要顺-反式异构酶（cis-trans isomerae）。而在这个特例里，涉及到的是3Z:2E烯醛异构酶（3Z:2E enal isomerase）。
来源：Characterization of 9-Fatty Acid Hydroperoxide Lyase-Like Activity in Germinating Barley Seeds That Transforms 9(S)-Hydroperoxy-10(E),12(Z)-octadecadienoic Acid into 2(E)-Nonenal.
从上图可以看到Z3N在前半段，而E2N位于整个9-氢过氧剪切酶样反应中的后半部分。而成品的反应产物并未检测到Z3N的存在，所以Kuroda就提出类9-HPL活性里包含3Z:2E烯醛异构酶的假设，但试验中无法分离提出异构酶。而他及后来者并没有继续尝试分离。
来源：Characterization of 9-Fatty Acid Hydroperoxide Lyase-Like Activity in Germinating Barley Seeds That Transforms 9(S)-Hydroperoxy-10(E),12(Z)-octadecadienoic Acid into 2(E)-Nonenal.
假设这个假说成立，那么这个亚油酸的降解途径就与黄瓜相似了。尽然Kurodo没办法提纯出异构酶，但我们可以用黄瓜的异构酶进行类比。目前所知，黄瓜的3Z:2E烯醛异构酶，pH5.5-9.5时，活性有50%以上。
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