原創 Jione、song 微生態 2019-10-18
導讀
大腸桿菌Nissle 1917（EcN）能穩定的定居於人類腸道，對各種腸道功能障礙具有有益的作用，例如嬰幼兒急性腹瀉，慢性便秘和腸易激綜合症患者的腹痛等。其已廣泛用於治療炎症性腸病，並且已有研究證明與黃金標準的美沙拉嗪在維持兒童和成人潰瘍性結腸炎的緩解方面一樣有效。儘管EcN在治療上已經使用了一個多世紀，但對其益生特性決定因素理解仍然不足。本研究利用λRed重組酶的方法順序構建了雙突變體，並使用缺失基因的上下游引物驗證了FRT盒的突變。隨後對在Mcc基因簇、iroA基因座和clbP-S95R中構建的EcN突變株進行大腸菌素遺傳毒性作用的檢測，用高效液相色譜/串聯質譜分析定性測量了C14-天冬醯胺細菌沉澱物的懸浮量。共培養EcN和EcN突變株，並系統的檢測此兩種競爭菌株的生長。20mg鏈黴素口服飼餵動物，隨後進行細菌感染，感染四天後終止，進行隨機臨床評分。最後，使用BLASTn和CA58 Mcc基因簇作為參考，搜索了一系列基因（mchB、mchA、mchK、mchL、mchS1、mchL、mchE、mchF）的序列，構建了系統發育樹。結果表明，EcN會產生基因毒素大腸菌素，這種毒素與某些大腸桿菌菌株的毒力有關，並可能促進結直腸癌的發病率。在體內沙門氏菌病模型中，突變體與野生型菌株相似地降低了沙門氏菌的臨床體徵和糞便脫落，而而clbP缺失突變體既不能保護病原體也不能與之競爭。體外觀察到帶有截短形式的Mcc基因簇和pks島的其他大腸桿菌菌株具有ClbP依賴性的抗菌作用。在EcN中共同進化說明了致病性和益生菌活性之間的微小差異，解決了益生菌有效性和安全性的需求，為安全使用EcN開闢了道路。
論文ID
原名：Deciphering the interplay between the genotoxic and probiotic activities of Escherichia coli Nissle 1917
譯名：解讀大腸桿菌Nissle 1917的遺傳毒性和益生菌活性之間的相互作用
期刊：PLoS PATHOGENS
IF：6.463
發表時間：2019年9月
通訊作者單位：圖盧茲大學
實驗設計
本研究利用λRed重組酶的方法順序構建了雙突變體，並使用缺失基因的上下游引物驗證了FRT盒的突變。隨後對在Mcc基因簇、iroA基因座和clbP-S95R中構建的EcN突變株進行大腸菌素遺傳毒性作用的檢測，用高效液相色譜/串聯質譜分析定性測量了C14-天冬醯胺細菌沉澱物的懸浮量。用含有利福平、鏈黴素、卡那黴素、羧苄青黴素或氯黴素的M63基本培養基共培養EcN和EcN突變株，並系統的檢測此兩種共培養競爭菌株的生長情況。20mg鏈黴素口服飼餵動物，隨後進行鼠傷寒沙門氏菌IR715、109以及EcN、EcN∆clbP、EcNclbPS95R等細菌感染，感染四天後終止，嚴重程度通過每天的體重減輕、腹痛、發燒和腹瀉的跡象進行評估，並進行最後的隨機臨床評分。最後，使用BLASTn和CA58 Mcc基因簇作為參考，搜索了一系列基因（mchB、mchA、mchK、mchL、mchS1、mchL、mchE、mchF）的序列，構建了系統發育樹，進行完整的生物信息學分析。
結果
1 EcN抗菌活性需要ClbP，但不需要大腸菌素合成途徑的其他組件
對CbP缺失的EcN突變體的抗菌活性檢測顯示，在ΔclbA突變體中EcN對LF82的抗菌活性沒有改變，但在ΔclbP突變體中不存在（圖1）。動力學實驗表明，EcN對LF82的抑制活性在接種後6小時開始，並在固定期開始時達到其在接種後8小時的最大值。ΔclbP突變體不會隨時改變LF82的生長，進一步表明EcN抗菌作用需要ClbP。這種EcN ClbP依賴性抑制活性在大腸桿菌和其他密切相關的細菌物種（如小腸沙門氏菌）的其他致病菌株中也觀察到。鼠傷寒沙門氏菌和產氣腸桿菌。
在突變體中，EcN對LF82的抗菌活性均未改變（圖1）。結果證實，成熟的大腸菌素或裂解產物N-酰基-D-天冬醯胺對EcN抵抗LF82的抗菌活性不是必需的。因此，EcN的拮抗活性顯然與pks / clb島和ClbP的存在有關，而大腸菌素不參與EcN的抑制活性。
圖1 pks/clb島在LF82細胞EcN抗菌活性中的作用
2 EcN ClbP依賴性抗菌活性需要MccH47和MccM
EcN對LF82的抗菌活性不受單獨的MccM前體基因mcmA或單獨的MccH47前體基因mchB缺失的影響（圖2）。相反，mcmA和mchB的缺失完全消除了EcN對LF82的抑制作用。同樣，缺失編碼基因mchE和mchF的MccM和MccH47外排泵導致抗菌活性降低（圖2）。與野生型EcN菌株相比，mchE和mchF的反式互補增加了EcN抑制活性（圖2），這可能是由於在過表達MchE-MchF外排泵後Mcc增加的輸出量。Mcc生產系統中的這些突變均未影響EcN產生活性大腸桿菌的能力。
在轉化LF82中編碼MccH47或MccM免疫基因的質粒，菌株對EcN具有抗性。EcNΔmchB突變體的抗菌活性在帶有MccM免疫基因mcmI的LF82上幾乎完全消失（圖4A）。使用攜帶MccH47免疫基因mchI的ΔmcmA突變體和LF82也獲得了相似的結果（圖4B）。結果證實，針對LF82的EcN抑制活性是由於MccH47和MccM引起的，並且該活性是ClbP依賴性的。
圖2 微黴素基因簇在LF82細胞EcN抗菌活性中的作用
圖4 ClbP催化和跨膜結構域在LF82細胞EcN抗菌活性中的作用
3 EcN ClbP依賴的抗菌活性是由於產生了鐵載體Mcc
在缺少鐵氧體腸抑菌素生產所必需的酶2，3-二羥基苯甲酸酯-AMP連接酶的ΔentE突變體中，對LF82的EcN抗菌活性大大降低（圖3）。EcNΔclbAΔentD雙突變體無法產生腸抑素，也出現了相似的結果（圖3）。將EcN突變體對編碼葡萄糖基轉移酶IroB、胞質酯酶IroD、周質酯酶IroE和輸出蛋白IroC的基因的抗菌活性與野生型EcN菌株的活性進行比較，僅iroB缺失導致EcN抗菌活性顯著降低（圖3），ΔiroB突變體的補充完全恢復了抗菌活性，iroA基因座中的這些突變均未影響EcN引起巨噬細胞增多的能力，表明大腸菌素具有遺傳毒性作用（圖3）。這些結果表明，IroB可能負責腸桿菌素糖基化，這使得Mcc前體蛋白在不存在McmL的情況下與鐵載體來源的部分連接。
mchC和mchD的EcN突變體失去了對LF82的抗菌作用，而互補作用則恢復了初始表型（圖2）。這些結果表明，EcN抗菌活性需要用腸桿菌素衍生的部分對MccH47和MccM進行翻譯後修飾。簡而言之，EcN ClbP依賴性抗菌活性歸因於鐵載體Mcc。
圖3 鐵素體在EcN抗菌活性中的作用
4 EcN的抗菌活性需要ClbP跨膜結構域，而不是周質肽酶結構域
與ClbP S95A或K98T互補的EcNΔclbP突變體顯示出與野生型ClbP蛋白相似的抗菌活性（圖4），而它們卻失去了引起與大腸菌素基因毒性作用相關的巨噬細胞的能力。
用帶有該融合物的質粒轉化的EcNΔclbP突變體表現出與EcN WT菌株相似的對LF82的抑制活性（圖4），但沒有引起巨噬細胞增多。因此，與僅對遺傳毒性活性至關重要的ClbP周質肽酶結構域相反，包含三個跨膜螺旋的ClbP C末端結構域對EcN抗菌活性至關重要。每個直系同源物在EcNΔclbP背景中的表達完全恢復了EcN的抗菌活性（圖5）。Mcc外排泵的過表達恢復了EcNΔclbP突變體的拮抗活性，而ClbP的過表達對EcNΔmchEF突變體的活性沒有影響（S6圖）。總之，ClbP可以充當輔助因子，促進EcN鐵載體Mcc的輸出。
圖5 一個失活ClbP催化域的基因組點突變可以消除EcN的基因毒性，但不影響LF82的抗菌活性
5 在clbP基因中具有點突變的EcN菌株具有非遺傳毒性，但仍具有拮抗活性，並減少了鼠傷寒沙門氏菌的腸道定殖和致病力
EcN突變體不會產生大量的前輔酶原切割產物N-酰基-D-天冬醯胺，並且對於感染的HeLa細胞沒有遺傳毒性，如組蛋白H2AX表型的陰性鉅細胞增多和磷酸化所示（圖5A和5B）。clbP-S95R突變體仍對LF82表現出抗菌活性，類似於野生型遺傳毒性EcN菌株（圖5C）。
當單獨給藥時，鼠傷寒沙門氏菌很容易在腸道內定植，這與較高的臨床評分和強腸沙門氏菌病有關（圖6）。在與野生型EcN並用的動物中，鼠傷寒沙門氏菌的糞便定殖和臨床評分明顯降低（圖6A和6B）。感染後第2天，EcN明顯勝過鼠傷寒沙門氏菌（圖6C）。相反，與EcNΔclbP突變體共同施用的動物表現出更高的臨床評分，並減少了鼠傷寒沙門氏菌定植的拮抗作用，證明了ClbP在急性沙門氏菌結腸炎中對EcN有益的作用。與野生型EcN相似，EcN clbP-S95R菌株可大大減少糞便脫落並勝過鼠傷寒沙門氏菌，並降低臨床評分（圖6）。
總之，這些結果表明，EcN的遺傳毒性活性可能與它的抗菌活性脫鉤，而且大腸菌素和鐵載體-Mcc的生物合成途徑相當複雜。
圖6 一個clbP缺失，但不是一個基因組點突變失活clbP催化域，損害EcN針對腸道病原體鼠傷寒沙門氏菌的保護
6 在帶有截短的Mcc基因簇和pks島的一部分大腸桿菌菌株中觀察到了ClbP依賴性抗菌活性
在EcN中，同時帶有截短的Mcc基因簇和pks島的三種野生型菌株均表現出顯著的抑制作用。所有三個相應的ΔclbP突變株的抑制作用均顯著降低，而ClbP互補則恢復了初始表型。相比之下，在僅攜帶pks島的菌株中，無論是用野生型菌株還是ΔclbP突變體培養，LF82的生長都沒有顯著差異。結果表明，肽酶ClbP參與了既帶有pks島又呈截短形式的Mcc基因簇的大腸桿菌菌株中的MccH47和MccM抗菌活性。結果還表明，這種關聯在致病菌和益生菌菌株中均存在。
7 pks，沙門氏菌素以及MccH47和MccM基因簇在大腸桿菌種群中的分佈
帶有截短的Mcc基因簇的大腸桿菌菌株表現出鐵載體-Mcc依賴性抗菌活性（圖7A）。這種抗菌活性需要產生基因毒素的細菌合成途徑中的ClbP和產生鐵載體沙門麥角菌素的生物合成途徑中的IroB。缺少負責翻譯後修飾的mcmL和mcmK基因的菌株都屬於B2系統群，並攜帶pks島和iroA（圖7B），除了被剝奪pks島的1105菌株。相反，攜帶mcmL / mchA和mcmK / mchS1的菌株屬於B1，C或D系群，而沒有pks島。這些特定的遺傳決定因素關聯導致了這樣一個假設，即截短的島幾乎僅存在於攜帶pks和iroA基因座的菌株中。這表明大腸菌素、沙門麥角菌素和鐵載體Mcc生物合成途徑之間的這種相互作用是由於在致病性或益生菌菌株中的共同選擇。
圖7 小菌素、pks和iro島在大腸桿菌中的組織與分佈
結論
EcN作為益生菌已使用了一個多世紀，具有許多治療益處。但現在人們開始擔憂EcN管理的安全性。據報道，EcN導致嬰兒嚴重敗血症，其基因組顯示出致病島pks，其編碼大腸埃希菌（coalbactin），大腸埃希菌菌株的真正毒力因子負責腸道外感染。另外，運輸產生大腸菌素的大腸桿菌也可能不利於腸內穩態。在成年大鼠中，它增加了腸上皮的通透性，並導致腸細胞遺傳毒性損傷的跡象，例如隱窩裂變和細胞增殖增加。在易患大腸癌的小鼠中，pks陽性的大腸桿菌增加了腫瘤的大小和數量。在幾項人類研究報告中，與對照組相比，大腸癌活檢中pks陽性的大腸桿菌過高。總體而言，這些研究表明，產生大腸菌素的細菌可以促進腫瘤發生。因此，本研究的目標是瞭解基因毒素大腸菌素的產生與pks島在EcN益生菌活性中的有益作用之間的相互作用。
在先前研究中，構建了一個非基因毒性的EcN PPTase ClbA突變體，該突變體也失去了其益生菌活性。隨後，發現PPTase ClbA有助於腸抑素（因此也包括沙門氏菌素）和耶爾西菌素的合成。在本研究中，證明了salmochelin（iroB）與Mcc基因簇之間存在協作關係，兩者均位於EcN基因組島I和pks島（clbP）上（圖8）。這些決定因素之間的交織是如此緊密，以至於大腸桿菌桿菌素和Mcc的生產都涉及單一蛋白ClbP。到目前為止，ClbP僅被描述為一種肽酶，可從前輔乳素中去除C14-天冬醯胺前藥支架。儘管具有三個跨膜螺旋的完整C末端結構域對於ClbP的生物活性是必需的，但催化活性是由N末端周質結構域完成的。在這項研究中，證明了由於MccH47和MccM，缺乏已知酶功能的ClbP的C末端域對於EcN拮抗活性是必需的。
儘管IroB似乎替代了EcN中不存在的腸桿菌素葡萄糖基轉移酶McmL，但McmK同源IroD對於EcN拮抗活性不是必需的。在沒有另一個腸桿菌素酯酶同系物的情況下，可以推測EcN Mcc的腸桿菌素部分不是線性的，而是保持環狀。此外，蛋白複合物MceIJ是肺炎克雷伯菌菌株E492中EcN MchCD的同系物，可識別並連接腸桿菌素的環狀和線性化糖基化衍生物。羅曼諾等最近證明ATP結合盒出口商McjD是Mcc J25的高度特異性。ATP結合和書出MchEF在MccH47和MccM生產菌株之間是保守的，無論微素基因簇是否“完整”（例如，MchE的差異僅為1.2％（n = 5），而MchE的差異僅為1.3％（n = 9））。在EcN和大腸桿菌H47之間的氨基酸水平上的MchF，帶有“完整的”鐵載體-Mcc基因簇。
在EcN中，結果顯示該泵的過表達消除了EcN拮抗作用的ClbP依賴性，並且與“ ClbP樣”蛋白的異源互補恢復了EcN的抗菌作用。因此，ClbP C末端跨膜結構域可以促進鐵載體Mcc的輸出（圖9）。最近的一項研究表明，在小鼠中共同給藥後，MCC是EcN勝過鼠傷寒沙門氏菌的關鍵因素。在本研究中，使用類似的小鼠感染模型，clbP的缺失導致部分對鼠傷寒沙門氏菌的保護作用喪失。相反，單核苷酸突變clbP-S95R與野生型益生菌一樣能有效地勝過鼠傷寒沙門氏菌並減少沙門氏菌病的臨床症狀。結合體外數據，表明EcN需要Mcc和ClbP，不需要成熟的大腸菌素或C14-天冬醯胺來保護鼠傷寒沙門氏菌。EcN clbP-S95R在感染的培養細胞中沒有誘導任何基因毒性跡象。這為工程設計可以安全使用的源自EcN的益生菌開闢了道路。
使用功能和生物信息學分析，證明了鐵載體Mcc，salmochelin和大腸菌素合成途徑之間的相互作用。令人驚訝的是，出現了兩組大腸桿菌菌株。一方面，所有攜帶“截短的” MccH47和MccM基因簇的菌株（例如，缺少mcmL / mchA和mcmK / mchS1的EcN菌株）都是B2菌株，它們也帶有pks島和iroA基因座。應該注意的是，在這組菌株中，來自尿液的分離物過多（CFT073，克隆D i14和D i2，UPEC 26-1和ABU 83972）。另一方面，攜帶“完整” MccH47和MccM基因簇的非B2菌株中不存在pks島和iroA基因座。所有這些菌株均從糞便中分離（ACN002來源未知）。因此，可以假設這些具有“完整” Mcc基因簇的菌株專門用於Mcc生產，以便在競爭性腸道環境中生存，這是它們的唯一優勢。相比之下，腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）必須是有效的腸道菌落定植者，才能從腸道利基中出現並感染其隨後必須適應的其他身體部位（例如泌尿道）。這就是為什麼有人認為ExPEC是“普通主義者”而不是專門的菌株。在研究中檢查的菌株符合該模型。它們可以根據環境表達多種毒力因子：例如MccH47和M，鐵載體和源自大腸菌素途徑的止痛脂肽。為了能夠用有限大小的基因組產生如此多的毒力或適應性因子，產生這些決定簇的裝配線的元件必須是通用的，並介入幾種明顯獨立的代謝途徑。
總之，pks島與EcN益生菌活性的聯繫甚至比預期的更為緊密。這種緊密聯繫可能反映了益生菌，適應性和致病因素的共同進化，以適應各種環境。通過專門針對ClbP的酶促結構域使拮抗劑與基因毒性活性脫鉤，為安全使用EcN開闢了道路。
結論
本研究旨在消除EcN的拮抗活性與它的遺傳毒性，結果顯示pks編碼的ClbP，即激活大腸桿菌的肽酶，是EcN拮抗活性所必需的。對一系列ClbP突變體的分析表明，該活性與ClbP的跨膜螺旋相關，而不與周質肽酶結構域相關，這表明跨膜結構域與Mcc生物合成或分泌的某些方面有關。ClbP中的單個氨基酸取代可滅活基因毒性活性，但保持拮抗活性。在體內沙門氏菌病模型中，該點突變體與野生型菌株相似地降低了沙門氏菌的臨床體徵和糞便脫落，而ClbP缺失突變體既不能保護也不能勝過該病原體。在EcN中觀察到的共同進化現象說明致病性和益生菌活性之間存在微小差異，解決益生菌需要有效性和安全性的策略。通過特異性滅活ClbP肽酶結構域使拮抗劑與基因毒性活性脫鉤，為安全使用EcN開闢了道路。
結論
大腸桿菌Nissle 1917（EcN）被用作益生菌已有一個多世紀的歷史。但是，它會產生基因毒素大腸菌素，這種毒素與某些大腸桿菌菌株的毒力有關，並可能引發結直腸癌，並且具有致癌性的菌株作為益生菌易引起公眾健康問題。因此，本研究的目標是將EcN的遺傳毒性活性與其拮抗作用分開，EcN的益生菌特性是其最獨特的特徵之一。結果證明，EcN的微素活性需要ClbP（一種產生大腸桿菌素的酶）和另一種參與鐵載體salmochelin合成的酶。這種相互作用是在其他大腸桿菌菌株中發現，從尿液中分離。因此，大腸桿菌菌株利用來自三種不同代謝途徑的決定簇來合成鐵載體微黴素。對大腸桿菌素生產必不可少的ClbP肽酶活性在鐵載體微黴素活性中無影響，這提供了一種構建保留其抗菌活性的非遺傳毒性菌株的方法，為安全使用EcN鑑定了基礎。
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