眾所周知，NGS 相比傳統的檢測技術，如 QPCR 和 Sanger 測序等，有著明顯的通量優勢，可在一次檢測中對上百萬甚至數十億個 DNA 分子進行大規模重測序，從而給出更為全面的疾病基因譜，使精準診療成為可能，也有助於發現一些未知的疾病相關基因變異。
隨著其技術的日趨成熟和成本降低，近年來，NGS 已被大規模推向了臨床應用，尤其是在腫瘤臨床實踐中，被用來進行腫瘤驅動基因測序、靶向用藥指導、腫瘤分子分型和精準診療等，還有更多的早篩和復發監測技術正在研發中。
不過 NGS 也因其技術較為複雜，影響因素較多，檢測內容不一，數據分析和解讀有難度，國內外都比較缺乏相關標準等原因，進一步規範化 NGS 的臨床應用成為了挑戰。在這個背景下，2018 年 7 月 10 日，由中華醫學會主辦的《中華醫學雜誌》在線發表了題為《二代測序技術在腫瘤精準醫學診斷中的應用專家共識》（以下簡稱《共識》）的最新文章，系統地闡述了 NGS 技術質量需求、臨床腫瘤相關 NGS 檢測內容、樣本處理、測序流程、數據管理、信息學分析、結果報告解釋和諮詢等方面的內容。
在樣本的採集和處理方面，《共識》指出適合臨床 NGS 分析的樣品類型包括新鮮組織，甲醛固定 - 石蠟包埋（FFPE）組織，腫瘤細胞學標本及血漿（遊離 DNA/RNA）等，但不管什麼樣本類型，都應對抽提後和文庫構建後的核酸樣本進行質控（聲明 11），關鍵點如下：
- 組織和血漿遊離核酸的檢測前質量控制分析，包括濃度和純度分析
- 組織 DNA 應進行核酸完整性分析，以判斷 DNA 質量
- 遊離 DNA 應進行片段長度分佈分析，以判斷是否存在血細胞基因組 DNA 汙染
- 文庫構建後，應對文庫濃度與片段長度分佈進行質量控制
NGS 的一個主要的挑戰在於：在樣本製備過程中，怎樣保證起始量低、質量參差的樣本，有一致的建庫成功率。核酸質量的高低對於 NGS 測序結果的影響非常大，尤其在 FFPE 組織樣本中，核酸降解的現象非常普遍，分子完整性較差，可被測序的模板含量較低，如果未經質控的樣品按照統一的常規流程去操作，極易造成文庫產量過低，PCR 重複率和偏好性指標升高等問題。前者會導致數據量不足，測序失敗，而後者會直接造成核酸分子的多樣性降低，與原始模板的偏差變大，從而導致檢測靈敏度和特異性的降低，產生假陰或假陽性結果。
在血漿樣品的檢測中，由於 cfDNA（遊離 DNA）或 ctDNA（循環腫瘤 DNA）的含量非常有限，血細胞 gDNA（基因組 DNA）的釋放或在核酸處理過程中引入的 gDNA 汙染，都會顯著降低 cfDNA 或 ctDNA 的濃度，不僅可能產生和上述 FFPE 樣品一樣的問題，還可能因為其攜帶的重要疾病基因信息被無意義的基因組數據干擾，給數據分析和解讀增加難度。
過去，樣品質控環節比較容易被忽視，或者存在一些誤區。比較典型的誤區是採用分光光度法或特異性熒光定量的方法來檢測核酸分子的濃度。但其實這些方法只能檢測核酸分子的濃度，卻無法判斷核酸的降解程度，更不能評價基因組 DNA 的汙染，故不能滿足《共識》的要求。
更為適合的樣品質控技術是基於 QPCR 的定量方法，如 KAPA hgDNA 定量和質控試劑盒 （通用型）產品（KK4960），針對人類基因組中的高保守區位點設計 3 種不同長度片段的 PCR 引物，分別用於檢測小片段、中片段和大片段的含量，並基於他們的相對比例來評估樣品的降解程度，不僅可準確定量可測序分子的濃度，更同步完成了片段大小 + 片段完整性的分析，一舉多得。該方法同樣適合評估遊離核酸樣品的質量和純度，大多數 cfDNA 和 ctDNA 的片段長度都介於 100-200bp 之間，因此，對於純度較高的樣品，原理上不應擴增出大片段產物，但若樣品中混有基因組 DNA 汙染時，就會很容易擴增出大片段產物，根據其絕對含量，即可評估初始樣品中的汙染程度。值得注意的是，NGS 測序反應本質上也是一種特殊的 PCR 反應，所以應用 QPCR 技術進行檢測，更能準確地反映出可被測序的模板含量，而不是所有核酸模板的含量，因此比分光光度法或熒光定量方法更為準確。當然，使用 QPCR 之前也需事先驗證 PCR 體系的聚合酶活性和擴增偏好等性能指標。
圖 1：人類基因組 DNA 定量及 QC 檢測原理。一組 DNA 標準品使用 3 對不同引物用於產生 3 組標準曲線。這 3 對引物的擴增目標位於人類基因組某高度保守的、單拷貝的區域，片段大小分別為 41 bp，129 bp 和 305 bp。41 bp 檢測用於 DNA 樣品的絕對定量，129 bp 和 / 或 305 bp 用於片段大小和完整性評估。由於低質量的 DNA 樣本的長片段擴增效率會大幅度降低，因此其降解程度可以通過 41 bp 檢測的濃度對於 129 bp 或者 305 bp 檢測的濃度進行標準化處理來進行推測，並用標準化質量分數（Q 值，介於 0 - 1 之間）進行量化評價。
文庫構建後，上機測序之前，為了最大化測序經濟性，平衡不同文庫混合後的通量均勻性，往往需要進行文庫定量質控。而合格的文庫定量亦如上述，需要採用適合的檢測技術才能保障測序結果的準確性。由於接頭連接反應效率、文庫擴增效率和接頭聚合體等諸多問題，採用分光光度法或熒光定量法同樣因為其定量原理的侷限性，無法排除上述干擾，導致定量高估或低估，進而造成測序數據不足或冗餘，所以採用基於 QPCR 的文庫定量方法仍是目前的“金標準”。
圖 2：基於 QPCR 文庫定量能高準確度地定量所有可測序分子。文庫製備流程中，DNA 插入片段和連接接頭會產生很多連接情況，除了兩端皆連接上接頭的分子可以被測序外，還有一些連接情況（單端連接或未連接）不支持後續的成簇擴增，不能被測序。QPCR 法僅檢測接頭連接正確的分子，這對於質控的有效性是特別關鍵的。分光光度法、熒光法和電泳法都只能檢測所有的雙鏈分子，且無法評估接頭的連接情況。文庫擴增後，有時過度的擴增會導致引物消耗殆盡，但變性和退火仍在進行，這些過程會產生不完全退火的部分雙鏈、部分單鏈的 DNA 異構體。此時，採用 dsDNA 結合染料的電泳法和熒光法僅能檢測完整的雙鏈 DNA 片段，導致對過度擴增文庫定量的低估。
綜上所述，好的樣品質控管理是產生符合臨床要求的高質量測序數據的大前提。《共識》不僅首次明確了質控流程對於規範化 NGS 樣品製備的重要性，還就進行質控和評價的方法給出了具體指導意見，這一進步實在意義重大。
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